慢性阻塞性肺疾病中MMP-9/TIMP-1與Th17/Treg作用與聯系

康彩云 吳世滿 劉曉君 劉 娟

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是慢性支氣管炎和肺氣腫患者出現肺功能檢查氣流受限、不完全可逆時的一種疾病。COPD是可以預防和可以治療的常見疾病[1]。COPD的發(fā)病機制復雜多樣，具體機制仍未清楚，缺乏有效的防治方法，因而發(fā)病率及病死率均較高。研究發(fā)現除了一些公認的發(fā)病機制外，自體免疫與COPD發(fā)病也存在較為密切的關系[2]。COPD再也不能被認為是一種只涉及肺的疾病，系統(tǒng)性炎癥反應的后果使它成為其他慢性并發(fā)癥的重要危險因素[3]。本研究選取COPD急性加重期、COPD穩(wěn)定期作為研究對象，健康吸煙肺功能正常，健康非吸煙肺功能正常者為對照組，分別抽血外周靜脈血，提取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，用流式細胞儀檢測各組Th17、Treg細胞分化水平，對各組間Th17、Treg分化水平進行比較，用酶聯免疫吸附法測定血漿中MMP-9和其抑制物TIMP-1含量，比較各組間MMP9、TIMP-1含量差異，并對MMP-9、TIMP-1含量與Th17、Treg分化水平相關性進行分析，旨在了解MMP-9/TIMP-1與Th17/Treg細胞在COPD自體免疫中的作用機制及其相互聯系。

資料和方法

一、研究資料

1. 研究對象： 搜集2013年3月至2013年12月來山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸內科就診的慢性阻塞性肺疾病患者55例，均符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組編寫的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)》診斷標準[1]。其中COPD急性加重期患者30例，男22例，女8例，年齡50歲～73歲，平均年齡64.00歲；COPD穩(wěn)定期25例，男19例，女6例，年齡46～75歲，平均年齡61.26歲。所有患者除外支氣管哮喘、支氣管擴張、肺間質纖維化、冠狀動脈性心臟病、風濕免疫性疾病及其他自身免疫性疾病病史。 肺功能正常組40例，為同期我院門診健康體檢者。健康吸煙肺功能正常組20例，男14例，女6例，年齡46～75歲，平均年齡59.25歲；健康非吸煙肺功能正常組20例，男13例，女7例，年齡46～75歲，平均年齡62.90歲。吸煙者為大于或等于10包/年。所有研究對象均知情同意，并經醫(yī)院倫理委員會批準。

2. 主要試劑及儀器： 混合單克隆抗體R-PE IL-17A、Alexa Fluor 647 Foxp3、FITC CD4，刺激劑、細胞固定液、細胞破膜液均購自美國Becton Dickinson公司。人基質金屬蛋白酶9 ELISA 試劑盒、人基質金屬蛋白酶抑制因子-1 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司。 流式細胞分析儀(美國Becton Dickinson公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司)，超凈工作臺(蘇州安泰)，酶標儀(美國寶特800)

二、研究方法

1. 搜集血漿和分離單個核細胞懸液： 全部研究者均于清晨留取空腹靜脈血5 ml，置于肝素鈉抗凝管中，以離心半徑8 cm，2000 r/min，離心10 min，取血漿分裝于EP管中-80 ℃凍存。取血漿后的血細胞用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)重懸，在離心管中加入3 ml淋巴細胞分離液，重懸血細胞加入淋巴細胞分離液上層，以離心半徑8 cm，2500 r/min，離心20 min，分離后吸取單個核細胞層于另一離心管中，用PBS洗滌一次，即可得到單個核細胞懸液。

2. 流式細胞術檢測Th17、CD4+Treg細胞： 制備得到單個核細胞懸液置于24孔培養(yǎng)板，加入1 ml 1640培養(yǎng)基和2 μl刺激劑在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，按照試劑盒說明加入抗體，經流式細胞儀檢測。

3. 血漿MMP9、TIMP-1 的測定： 采用酶聯免疫吸附法測定血漿中MMP9、TIMP-1的含量，按照試劑盒說明書操作，用酶標儀450 nm測定OD值。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、一般情況

各組性別、年齡比例比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.736，P>0.05；F=1.215，P>0.05。肺功能指標比較：COPD急性加重期組存在明顯氣流受限，與健康吸煙組和健康不吸煙組比較，FEV1% pred、FEV1/FVC差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與COPD緩解期組相比差異無統(tǒng)計學意義，但急性期組氣流受限更明顯；COPD緩解期與健康吸煙組和健康不吸煙組比較，FEV1% pred、FEV1/FVC差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);健康吸煙組與健康不吸煙組相比，差異無統(tǒng)計學意義，但健康吸煙組FEV1/FVC、FEV1%pred較不吸煙肺功能正常組有所下降，見表1。

二、各組外周血Th17、Treg細胞占CD4+細胞的比例和Th17/Treg的比值的比較

外周血Th17/CD4+T(%)比較：COPD急性期組高于緩解組、健康非吸煙組、健康吸煙組(F=22.264，P<0.05)；COPD緩解期組與健康吸煙組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與健康非吸煙組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

外周血Treg/CD4+T(%)比較：各組差異無統(tǒng)計學意義(F=1.971，P>0.05)。

表2 各組外周血Th17、Treg細胞占CD4+T細胞的比例和Th17/Treg的比值比較

Th17/Treg比值的比較：COPD急性加重期組顯著高于COPD緩解期組、健康吸煙組、健康非吸煙組(F=15.029,P<0.05)；COPD緩解期組與健康吸煙組、健康非吸煙組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

三、各組血漿MMP-9、TIMP-1 濃度、MMP-9/TIMP-1比值的比較

1. 血漿中MMP-9含量的比較：COPD急性加重期組顯著高于COPD緩解期組、健康吸煙組、健康非吸煙組(F=171.545，P<0.01)；COPD緩解期組與健康吸煙組、健康非吸煙組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),健康吸煙組與健康非吸煙組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2. 血漿中TIMP-1含量的比較：COPD急性加重期組含量顯著高于其他三組(F=5.420，P<0.05)；COPD緩解期組與健康吸煙組、健康非吸煙組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但健康吸煙組比較相對略高。

表1 研究對象的一般情況

3. 血漿中MMP-9/TIMP-1比值的比較：各組相比，整體差異有統(tǒng)計學意義，(F=15.029，P<0.01),COPD急性加重期組與其他三組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；COPD緩解期組與健康組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；健康吸煙組與健康非吸煙組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但健康吸煙組其比值相對較高，見表3。

表3 各組血漿中MMP-9、TIMP-1含量和MMP-9/TIMP-1的比值比較

四、各組MMP9、TIMP-1/MMP-9/TIMP-1與Th17/CD4+ T(%)、Treg/CD4+ T(%)、Th17/Treg相關性

COPD急性加重期組、COPD緩解期組MMP-9與Th17/CD4+T(%)存在相關性(r值0.376，P<0.05/r值0.459，P<0.05)。健康吸煙組和健康非吸煙組均無相關性。TIMP-1與Treg/CD4+T(%)之間，MMP-9/TIMP-1比值與Th17/Treg比值之間，MMP-9與Th17/Treg比值間，在各組均無相關性。

討 論

近年來研究發(fā)現COPD發(fā)生機制是多種因素共同作用的結果，其中MMP-9和TIMP-1平衡失調即MMP-9/TIMP-1比值的變化在COPD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現Th17和Treg平衡失調在COPD的發(fā)生發(fā)展有重要作用[5-6]。本研究對這兩種發(fā)病機制的特點及相關關系進行了研究。

MMP-9是細胞外基質降解的主要蛋白酶，主要通過金屬鋅或鈣離子介導引起肺泡壁細胞外基質和基底膜的損傷和降解，破壞正常的肺泡結構，引起肺泡腔的擴大，參與氣道重構而導致氣道阻塞。TIMP-1是MMP-9的天然抑制因子，主要通過抑制MMP-9活性，在肺泡壁細胞外基質和基底膜的修復過程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究中COPD急性期組MMP-9含量、TIMP-1含量及MMP-9/TIMP-1比值均明顯增高，提示其參與了COPD急性期肺組織進一步損傷，使患者局部和全身炎癥反應加重，表現為咳嗽、咳痰癥狀加重及呼吸困難明顯、全身乏力、心律失常、電解質紊亂等并發(fā)癥。COPD穩(wěn)定期組與健康組對比MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值亦有所增高，所以穩(wěn)定期患者也存在長期慢性咳嗽、咳痰癥狀及活動后氣短癥狀。另外，MMP-9、TIMP-1含量及TIMP-1比值較健康組增高，提示其可能也參與了肺結構的慢性破壞和重塑，并使氣道杯狀細胞的增生、化生和黏液增加，導致氣道慢性炎癥和肺氣腫，使肺功能指標逐年下降，引起長期的慢性咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀。正常情況下肺組織不表達或僅表達微量的MMP-9，但在各種刺激下，肺的實質細胞如支氣管上皮細胞、Ⅱ型肺泡細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及內皮細胞和肺的各種炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肺泡巨噬細胞、肥大細胞及自然殺傷細胞與樹突狀細胞等均能產生MMP-9[8-9]。健康吸煙者由于長期煙草煙霧的刺激，其MMP-9、TIMP-1含量有所增加，可能長期存在氣道損傷和重塑，所以吸煙是慢性阻塞性肺疾病的重要危險因素。

本研究發(fā)現COPD急性加重期與緩解期組、健康吸煙、健康不吸煙組比較，Th17占CD4+T淋巴細胞比例增高，差異有統(tǒng)計學意義，Treg與其他各組差異無統(tǒng)計學意義，但較健康對照組有所增加。Th17/Treg比值較緩解期組、健康對照組增高，存在平衡失調。COPD緩解期組Th17、Treg均增高，但是Thl7/Treg尚處于平衡狀態(tài)。健康吸煙組Th17比例已有所增高，可能由于煙草煙霧及香煙有害物能損傷氣道，釋放自身抗原物質激發(fā)自體免疫反應。Th17細胞是新發(fā)現的輔助性T細胞，因其特異性的分泌IL-17而得名。Thl7細胞在肺內高表達可能是導致煙草煙霧暴露小鼠肺內慢性炎癥反應持續(xù)的原因之一，戒煙是能夠延緩COPD患者肺功能進行性下降的有效措施之一[10]。Treg細胞是一群具有調節(jié)機體免疫反應的淋巴細胞，是重要的免疫調節(jié)細胞，能保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，避免不必要的、過度的免疫應答，具有明顯的抗炎和自身免疫調節(jié)作用。Th17與Treg細胞類似于Thl與Th2之間的平衡，兩者功能相互拮抗，兩者之間平衡維持或破壞對于免疫穩(wěn)定或炎癥性疾病的發(fā)病具有重要意義。

本研究中亦發(fā)現在COPD急性期和緩解期患者，其血漿MMP-9增高時Th17細胞表達也增高，兩者存在一定相關性。其機制可能為COPD患者由于多種炎癥介質刺激Th17細胞高表達，其分泌IL-17增高，通過募集過多炎癥細胞如中性粒細胞和巨噬細胞到達炎癥部位，釋放更多的MMP-9、彈性蛋白酶等[11]，從而進一步造成肺組織損傷、基質損傷釋放彈性蛋白片段，而彈性蛋白片段作為自身抗原激活自體免疫反應，刺激組織炎癥反應加重，釋放更多炎癥介質，形成“瀑布效應”。另外在各種感染、化學性刺激物、煙草煙霧等刺激下，肺的實質細胞如支氣管上皮細胞、Ⅱ型肺泡細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及內皮細胞和肺的各種炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肺泡巨噬細胞、肥大細胞及自然殺傷細胞與樹突狀細胞等均能產生MMP-9，可能MMP-9也會通過IL-6、TGF-β影響CD4+T細胞分化，使Th17表達增高，使Treg表達下降。Sylvester等[12]研究發(fā)現，IL-l7能通過NF-kB信號轉導通路誘導牛軟骨細胞表達引起MMP-9的表達增高，在人體內是否存在IL-17通過其通路使支氣管上皮細胞、Ⅱ型肺泡細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及內皮細胞和肺的各種炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肺泡巨噬細胞、肥大細胞及自然殺傷細胞與樹突狀細胞等釋放MMP-9增高，尚需進一步研究。

綜上，MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17細胞、Th17/Treg在COPD急性加重期組明顯增高，在COPD緩解期組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17細胞與健康組比較增高明顯，所以COPD患者可能存在自體免疫介導的慢性炎癥反應，通過免疫調節(jié)劑的治療，有望阻斷自體免疫反應，進而緩解和控制COPD的進展。健康吸煙組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17、Th17/Treg均較健康非吸煙組升高。所以吸煙容易促發(fā)炎癥反應，戒煙對防治慢性阻塞性肺疾病是非常重要的。另外在COPD組，MMP-9與Th17占CD4+T比例呈正相關，其確切機制有待進一步研究，這可能也將為慢性阻塞性肺疾病尋找到一個新的治療靶點。

參 考 文 獻

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