卡介苗對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥的預防治療作用及機制研究

劉晨濤 薄建萍 加 慧 董艷婷 田新瑞

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡稱哮喘)，是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，以氣道的高反應性(airway hyperreactivity, AHR)和氣道炎癥為重要特征。在氣道炎癥發生機制中，上皮細胞損傷、間質增生發揮主要作用。本研究通過復制哮喘大鼠氣道炎癥模型，給予地塞米松、接種卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)及BCG治療干預，觀察肺泡灌洗液(bronehoalveolar lavage fluid, BALF)細胞及嗜酸性粒細胞總數、上皮間質標志物變化，探討氣道上皮細胞的損傷和間質改變在哮喘氣道炎癥發病機制中的作用及BCG對支氣管哮喘氣道炎癥的預防治療作用及機制。

材料與方法

一、實驗材料

選擇SPF級Wistar雄性大鼠40只，2～3個月齡，體質量160～180 g(由山西醫科大學實驗動物中心提供)，隨機分為5組，每組8只動物。卵白蛋白(ovalbumin, OVA)(由美國sigma公司生產)；氫氧化鋁(aluminumhydroxide, Al(OH)3)(由天津化學試劑三廠生產)，彩云JWC-201D型霧化器(由鞍山市同信醫用儀器廠生產)；地塞米松磷酸鈉注射液5 mg/1 ml/支(山東新華制藥股份有限公司)；BCG 0.5 mg/支(成都生物制品研究所有限責任公司)；TGF-β1 ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司)；E-cadherin 、Fibronectin、α-SMA小鼠抗大鼠一抗(SantaCruz公司)，FITC標志的羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，SABC抗鼠試劑盒及DAB顯色劑(武漢博士德生物公司)。

二、實驗方法

1. 實驗分組： 取40只SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為對照組、哮喘組、BCG治療組、地塞米松治療組、BCG接種組；哮喘組、BCG治療組、地塞米松治療組均于實驗第1、8天對大鼠腹腔注射OVA 100 mg和氫氧化鋁100 mg混懸液1 ml進行致敏，第15天開始每日激發前30 min分別給予腹腔注射蒸餾水0.16 ml、皮內注射BCG 0.025 mg、腹腔注射地塞米松0.25 mg/kg，并將大鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內，予1% OVA蒸餾水30 ml霧化吸入30 min，1次/d，共2周。BCG接種組在OVA致敏前7、3、1 d，每只大鼠分別皮內注射BCG 0.025 mg，余處理同哮喘組，對照組均給予蒸餾水替代處理。

2. 標本制備： 每只大鼠在末次霧化后的24 h內用25%烏拉坦0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟，心臟穿刺取血約5 ml，4 ℃，以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，留取血清，置-80 ℃冰箱中保存待測；暴露氣管，放留置針，用NS行左全肺灌洗，每次1 ml，充分回收，反復3次，共回收約2 ml，20 ℃，以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，留取上清，置-80 ℃冰箱中保存，行ELISA檢測，留取沉淀行細胞總數及嗜酸性粒細胞計數。取大鼠右肺，置0.1 mol/L的多聚甲醛中固定，用于組織病理學分析。HE染色觀察支氣管、小血管管壁、肺泡及肺間隔內細胞浸潤情況、水腫和上皮損傷程度，支氣管平滑肌改變情況等，免疫組織化學染色(SABC法)檢測大鼠肺組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin的表達。

3. 圖像分析： HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測量支氣管基底膜周徑(Pbm)。支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內氣管面積(AMe)，平滑肌內緣內氣管面積(AMi)。計算公式：支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbra，平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm；衡量氣道改變情況[1]。

三、統計學方法

結 果

一、癥狀觀察

哮喘組大鼠致敏激發后出現煩躁不安、抓耳撓腮、易驚、尖叫、然后伏俯不動、口唇紫紺、呼吸急促、大小便失禁、部分腹部肌痙攣等過敏反應[2-3]；治療組、接種組和對照組相對安靜，過敏反應隨治療時間的延長癥狀漸減輕。

二、肺組織病理學檢查

對照組肺組織及支氣管均無炎癥改變，見圖1。哮喘組外觀上見肺體積增大，表面腫脹，有不規則暗紅色充血區；支氣管及肺泡內黏液分泌增多，大量炎性細胞浸潤：淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞等；支氣管管壁變厚、氣道變窄，氣道上皮受損腫脹，部分可見脫落，見圖2。BCG組、地米組、BCG接種組與哮喘組相比上述改變明顯減輕，但變化仍明顯于對照組，見圖3。各組大鼠支氣管肺泡灌洗液細胞總數及嗜酸性粒細胞計數，見表1。各組大鼠支氣管管壁厚度，見表2。各組大鼠肺泡灌洗液、血清中TGF-β含量比較，見表3。各組大鼠肺組織中E-cadherin、β-catenin、α-SMA、Fibronectin表達的比較，見表4。

表1 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數及嗜酸性粒細胞計數(EOS)

(對照組)

表2 各組大鼠支氣管壁及平滑肌的厚度

注：與對照組相比：aP<0.01；與哮喘組相比：bP<0.01；與BCG組比較：cP<0.01

(哮喘組)

表3 各組大鼠肺泡灌洗液、血清TGF-β含量

注：與對照組相比：aP<0.01；與哮喘組相比：bP<0.01；與BCG組相比：cP<0.01；與地米組相比：dP<0.01

討 論

支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等多種炎性細胞參與的以氣道變應性炎癥、AHR及可逆性氣道阻塞為特征的疾病。氣道的慢性炎癥被認為是哮喘的本質[4-5]，從哮喘的主要誘發因素以及對哮喘患者病理研究發現，免疫反應是哮喘患者產生氣道慢性炎癥的主要原因[6]。嗜酸性粒細胞是支氣管哮喘發病機制中的主要效應細胞[7]，與哮喘氣道炎癥、氣道重塑、肺中痰聚集及氣道高反應性及哮喘病情的嚴重程度有關[8-11]。支氣管哮喘早期病理改變主要是支氣管黏膜的腫脹、充血、分泌物增多、氣道內炎性細胞浸潤、氣道平滑肌痙攣等一些可逆性的病理改變。

哮喘的經典發病機制是輔助性T淋巴細胞Th1/Th2 亞群比例失衡和功能紊亂，正常情況下，兩者處于相對平衡狀態，維持機體正常的細胞和體液免疫功能[12-13]。調節性T細胞是維持人體外周免疫耐受的重要因子[14-15]，調節性T細胞根據來源不同，主要分為天然型和誘導型Tr細胞。誘導性調節性T細胞(iTregs)是多種環境因素在幼稚T細胞中誘導產生的具有調節活性的T細胞，主要包括Trl 和Th3細胞兩種類型[16]。Tr1主要通過分泌IL-10來抑制T細胞的增殖，具有旁觀者抑制效應和免疫記憶力；Th3主要分泌TGF-β來實現對Th1和Th2的抑制作用[17]。

本研究中觀察到哮喘大鼠BALF中細胞總數、EOS計數及BALF及血清中TGF-β1含量增加，氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，氣道變窄，氣道上皮受損腫脹，部分可見脫落，間質細胞增多，基底膜增厚，支氣管及肺泡內黏液分泌增多，大量炎性細胞浸潤，多為淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞等。SABC法測得間質標志物Fibronectin、α-SMA表達增加，平滑肌細胞增生，上皮標志物E-cadherin表達降低，表明哮喘性慢性炎癥致TGF-β1含量增加、上皮細胞損傷間質細胞增多是哮喘氣道炎癥形成的重要機制之一。

(BCG組) (地米組) (BCG接種組)

表4 各組大鼠肺組織中E-cadherin、α-SMA、Fibronectin平均光密度值

注：與對照組相比：aP<0.01，bP<0.05；與哮喘組相比：cP<0.05；與BCG組相比：dP<0.01；與地米組相比：eP<0.01

BCG是經熱酚法提取的多糖酸類物質，并具有活化巨噬細胞、增強T細胞、B細胞介導的細胞免疫和體液免疫功能，目前已廣泛應用于臨床治療哮喘等自身免疫性疾病[18]。研究證實BCG可以減少OVA激發的氣道炎癥及重塑，其中氣道周圍α-SMA水平、氣道纖維化及氣道上皮黏液堆積也減少，BCG還可減少TGF-β1的表達[19]，這可能與其能誘導機體的Th1免疫功能有關。地塞米松是經典的抗炎、治療哮喘的藥物，眾多實驗結果表明，地塞米松能干預氣道炎癥中嗜酸性粒細胞及氣道重塑中平滑肌的增殖過程，延緩氣道炎癥及重塑的進程。本研究顯示地塞米松治療組大鼠，氣道炎癥及氣道阻塞不明顯，BALF中細胞總數及EOS計數明顯減少，BALF及血清TGF-β1含量較哮喘組明顯下降，上皮細胞損傷間質轉化顯著減輕，SABC法測得E-cadherin表達明顯升高，Fibronectin、α-SMA的表達明顯下降，與哮喘組差異有統計學意義(P<0.01)。與地塞米松治療哮喘相比，BCG具有調節免疫、副作用小、應用方便的優勢，但其對支氣管哮喘氣道炎癥及氣道阻塞的預防及治療作用的機制，目前研究及報道甚少。本研究中BCG接種組及BCG治療組與哮喘組相比，大鼠BALF中細胞總數及EOS計數明顯減少，氣道炎癥明顯減輕，BALF及血清中的TGF-β1含量下降，氣道壁及平滑肌無明顯增厚，氣道阻塞程度、上皮細胞損傷間質轉化明顯減輕，α-SMA、Fibronectin表達下降，E-cadherin表達增加，其差異具有統計學意義(P<0.01)，表明接種BCG和BCG治療對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道阻塞具有預防和治療作用。其機制可能是通過免疫調節抑制TGF-β1表達，阻斷了TGF-β1所致的上皮細胞損傷間質轉化。提示預防接種BCG可以達到與地塞米松治療相同的減輕氣道炎癥的作用。緩解期哮喘采用BCG及類似物進行免疫調節，有可能減少或控制哮喘發作。

綜上所述，支氣管哮喘發生時，TGF-β1含量增加介導的上皮細胞損傷間質轉化是其重要機制之一。接種BCG及采用BCG治療可減輕哮喘大鼠氣道炎癥及氣道阻塞程度，這可能是通過BCG對Th1的免疫調節作用，使得TGF-β1含量下降，上皮細胞間質轉化減少實現的。本研究結果為臨床應用BCG治療哮喘提供了實驗依據。

參 考 文 獻

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