青蒿素、哌喹、磷酸哌喹抗性系殺蟲速度實(shí)驗研究*

★ 鄭紹琴 高巖 陳穎 陳沛泉 宋健平*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司 廣東 廣州 510445；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510405)

根據(jù)最新情況估計，2010年約有2.19億瘧疾病例，不確定范圍為1.54億至2.89億，有66萬人死亡，不確定范圍為49萬至83.6萬[1]。81%瘧疾病例和91%死亡發(fā)生在世衛(wèi)組織非洲區(qū)域。自2000年以來，全球瘧疾死亡率已下降25%以上，世界衛(wèi)生組織非洲區(qū)域降幅達(dá)33%。大多數(shù)死亡發(fā)生在非洲兒童中，平均每分鐘就有一名兒童死于瘧疾[2]。抗瘧藥的應(yīng)用，是瘧疾防治的重要手段之一，也是人類抗擊瘧疾的主要武器，在人類與瘧疾的斗爭中發(fā)揮了重要的作用。但是，抗瘧藥的現(xiàn)狀并不樂觀，抗藥性瘧原蟲的出現(xiàn)，使得瘧疾的防治工作面臨困境[3]，即使是青蒿素這種目前應(yīng)用于抗瘧一線的短半衰期、高效、速效、低毒的抗瘧藥，2006在泰-柬邊界常規(guī)藥效檢查中發(fā)現(xiàn)第一例惡性瘧原蟲對青蒿素類產(chǎn)生抗性的證據(jù)[3]，2009年，泰-柬邊境確診出現(xiàn)惡性瘧原蟲對青蒿素耐藥，后來又在緬甸和越南等地發(fā)現(xiàn)同樣情況[4]。瘧原蟲對抗瘧藥物的敏感性檢測為抗瘧藥的合理使用與抗瘧措施的制定提供依據(jù)。殺蟲速度實(shí)驗通常用于評價抗瘧藥殺滅瘧原蟲速度的快慢程度，本研究對培育出的抗藥性蟲系與敏感株進(jìn)行殺蟲速度實(shí)驗，觀察是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲株 伯氏瘧原蟲K173(Plasmodium berghei K173，P.b.K173)株，1997年4月引自美國國立衛(wèi)生研究院，血傳與液氮冷凍交替進(jìn)行保種。2012年12月3日復(fù)蘇。

青蒿素抗性系由P.b.K173經(jīng)大劑量復(fù)燃法抗性培育至35代得到，抗性指數(shù)I90為4.4，2012年12月3日復(fù)蘇。

哌喹抗性系由P.b.K173經(jīng)大劑量復(fù)燃法抗性培育至35代得到，抗性指數(shù)I90為43.0，2012年12月3日復(fù)蘇。

磷酸哌喹抗性系由31代抗性系經(jīng)大劑量復(fù)燃法繼續(xù)培育至35代得到，抗性指數(shù)I90為103.5。磷酸哌喹31代抗性系由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所饋贈，2012年2月28日復(fù)蘇。

1.1.2 實(shí)驗動物與動物房 SPF級昆明小鼠，雌雄各半，鼠齡4～5周，體重(20±2)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，合格證號：SCXK-(粵)2008-0020。

小鼠隨機(jī)分組，自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園藥理研究中心實(shí)驗動物室，溫度(20～25)℃，相對濕度(40～70)%，光照時間12h。

1.1.3 實(shí)驗藥物 青蒿素(Artemisinin，ART)購自廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司，批號100651，含量100.3%。

哌喹(piperaquine，PQ)購自廣東新南方青蒿科技有限公司，批號110804，含量為100.5%。

磷酸哌喹(Piperaquine phosphate，PQP)購自重慶康樂制藥有限公司，批號LPK-100302-M，含量為99.6%。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗方法 實(shí)驗分為6個組，即：ART組、PQ組、PQP組、ART抗性系組、PQ抗性系組和PQP抗性系組，每組小鼠15只。給藥劑量設(shè)為各藥ED90的100倍，即：ART 4646mg/kg，PQ 335mg/kg，PQP 836mg/kg。

參照WHO Tech Rep Ser No.529(1973)的方法[5]，每組用各自種源鼠腹腔接種感染。每只試驗鼠接種1×107個伯氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，當(dāng)試驗鼠瘧原蟲紅細(xì)胞感染率達(dá)到10%左右時灌胃給藥一次，給藥后每6h取尾血涂片鏡檢，連續(xù)觀察48h。

1.2.2 評價指標(biāo) 查血片計算小鼠紅細(xì)胞原蟲感染率(%)，查完2×104個紅細(xì)胞未見原蟲者定為陰性。用直線回歸方程計算原蟲下降回歸系數(shù)(b)和原蟲下降50%和90%的時間(CT50和CT90)，并按下式計算原蟲殘存率(%)。

2 結(jié)果

2.1 敏感株對P.b.K173殺蟲速度實(shí)驗結(jié)果

PQ與PQP使原蟲下降速度大致相同，CT50/CT90分別為13.34h/32.16h、13.91h/34.47h，；ART的CT50/CT90為17.38 h/38.79 h。

表1 ART、PQ和PQP對P.b.K173株給藥后不同時間原蟲密度變化

表2 ART、PQ和PQP對P.b.K173株的殺蟲速度

2.2 抗性系對P.b.K173殺蟲速度實(shí)驗結(jié)果 35代ART抗性系殺蟲速度的CT50/CT90為15.32h/40.21h；PQ、PQP抗性系在48h殺蟲速度實(shí)驗過程中，其原蟲感染率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，至第48h，其感染率(20.54±3.62)%、(23.90±2.60)%明顯高于藥前的(9.98±1.49)%、(9.91±0.87)%。

圖1 ART、PQ和PQP對P.bK173殺蟲速度實(shí)驗

表3 ART、PQ和PQP抗性系對P.b.K173株給藥后不同時間原蟲密度變化

表4 ART抗性系對P.b.K173株的殺蟲速度

圖2 ART、PQ和PQP抗性系對P.bK173殺蟲速度實(shí)驗

圖3 抗性系與敏感株對P.bK173殺蟲速度實(shí)驗

3 討論

殺蟲速度實(shí)驗通常用于評價抗瘧藥殺滅瘧原蟲速度的快慢，本實(shí)驗選擇具有重度抗性(I90為103.5)的磷酸哌喹抗性系作為參照組，與具有輕度抗性(I90為4.4)的青蒿素抗性系、中度抗性(I90為43.0)的哌喹抗性系進(jìn)行48h殺蟲速度實(shí)驗，結(jié)果顯示，具有輕度抗性的青蒿素抗性系與其敏感株在殺蟲速度方面沒有顯著差異；而具有中度抗性的哌喹抗性系與其敏感株在殺蟲速度方面則存在較顯著的差異，具有重度抗性的磷酸哌喹抗性系與其敏感株在殺蟲速度方面存在的差異與哌喹相同，提示抗性系與敏感株在殺蟲速度方面存在的差異并不是偶然現(xiàn)象。這一結(jié)果也容易理解，未產(chǎn)生抗藥性的瘧原蟲對抗瘧藥具有一定的敏感性，體現(xiàn)在殺蟲速度上，即原蟲感染率或原蟲殘存率隨時間變化呈現(xiàn)出下降的趨勢甚至為0；而對于培育出的抗性蟲系，由于瘧原蟲對抗瘧藥產(chǎn)生了一定程度的耐藥性，使得藥物對原蟲的敏感性在逐步下降，體現(xiàn)在殺蟲速度上，即原蟲感染率或原蟲殘存率隨時間變化呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢，藥物沒能對瘧原蟲起到相應(yīng)的殺滅作用，原蟲按其生長周期繼續(xù)進(jìn)行繁殖。

本實(shí)驗結(jié)果提示，根據(jù)抗性系與敏感株在殺蟲速度方面存在的差異，可將48h殺蟲速度實(shí)驗作為抗瘧藥敏感性檢測的一種方法來應(yīng)用。

[1]WHO.Media centre. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/en/index.html，2013-03.

[2]WHO. Global estimates of malaria cases and deaths 2000-2009[M].World Malaria Report, 2011:72-74.

[3]Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH, et al. Epidemiology of drug-resistant malaria. Lancet Infect Dis[J].2002,2(4):209-218.

[4]WHO. Malaria deaths are down but progress remains fragile.Geneva, 2011.

[5]World Health Organization. WHO Technical Report Series No:529[R].Geneva,1973.