通脈大生片對腎虛排卵障礙型不孕大鼠卵巢指數和FSHR mRNA表達的影響*

★ 溫瑩瑩 傅春華* 弓麗華 黃金珠 周昕

(成都中醫藥大學 四川 成都 610075)

不孕癥是婦科臨床的常見病，正成為全球生殖醫學領域一個緊迫和日益引起關注的熱點與難點問題。據統計不孕癥在我國的發病率約為10%[1]，而排卵功能障礙型不孕約占女性不孕癥的25%～30%[2]。以“補腎調沖”立法的通脈大生片是成都中醫藥大學附屬醫院的院內制劑，應用于臨床50多年，其促排卵作用已被大量臨床病例所證實，具有確切療效[3]。本研究在前期實驗基礎上通過建立腎虛排卵障礙型不孕大鼠模型，用熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠卵巢FSHR mRNA表達量，闡明通脈大生片對卵泡發育和促排卵的干預環節，從分子生物學角度探討其作用機制，進一步深化補腎調沖法促排卵的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級9日齡相同日期出生的雌性SD大鼠200只。四川簡陽達碩生物科技有限公司提供，生產許可證號：SCXF(川)2008-24。

1.2 藥物 通脈大生片(規格：每片含0.3g原生藥)，批號：川藥制字20130530，由成都中醫藥大學附屬醫院生產。來曲唑(規格：2.5mg)，批號：國藥準字H19991001，由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產。右歸丸(規格：1.8g/10粒)，批號：國藥準字Z41022170，由河南宛西制藥股份有限公司生產。丙酸睪酮注射液(規格：1mL：25mg)，批號：國藥準字H12020531，由天津金耀氨基酸有限公司生產。

1.3 試劑 Eastep通用型總RNA 提取試劑盒(LS1000)，Promega；RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(K1621)，Fermentas；Maxima SYBR Green/ROX qPCR預混液(K0221)，Thermo Scientific；DEPC(Sigma)。

1.4 主要器材 高分辨率熔點曲線分析儀(BIO-RAD，CFX96)；電泳儀及電泳槽 (北京六一)；凝膠圖像分析系統(BIO-RAD)；超低溫冰箱(SANYO，MDF-U50V)；高速冷凍離心機(Sigma，1-15K)等。

2 方法

2.1 造模 參照余瑾等[4]方法復制排卵障礙型不孕大鼠模型。取9日齡SD雌鼠180只(實驗組)，于頸背部皮下注射丙酸睪丸酮1.25mg/只(0.05mL/只)。第22日齡斷奶，同等條件飼養，由專人喂養。若大鼠表現為體重肥胖，易驚易怒，豎毛，毛質晦暗發黃，脫毛(以上表現與空白組進行對照)，提示腎虛證造模成功。待70日齡，大鼠陰道開口，連續陰道涂片2個性周期(1個性周期5天)。若陰道上皮無周期變化，呈持續性角化，提示排卵障礙大鼠模型造模成功。

2.2 分組 按隨機數字表法將126只實驗組大鼠分為疾病模型組(簡稱模型組)、通脈大生片高、中、低劑量組(簡稱通高、中、低組)、右歸丸組、來曲唑組，每組各21只，加上正常組20只，共7組。

2.3 給藥 從80日齡起，分別按如下方法稱重灌胃，每天1次。以臨床成人60kg體重為標準，按照體表面積-劑量換算法計算大鼠給藥劑量。按1mL/(100g·d)體重灌胃，通高、中、低組分別按臨床成人用藥量的20倍、10倍、5倍灌胃；右歸丸組按臨床成人用藥量的10倍灌胃；來曲唑組按臨床成人用藥量的10倍灌胃，連續灌胃2天后停藥3天，并予陰道涂片。直至陰道涂片提示陰道脫落細胞出現有規律的周期性變化后停藥。于灌胃5周時出現陰道脫落細胞周期性變化。

2.4 標本采集 第105日齡時處死各組大鼠，剖腹，取出卵巢組織，剝離干凈后觀察卵巢形態并稱重，記錄卵巢各項指標。于-80℃保存用于mRNA的定量分析。

2.5 卵巢組織FSHR mRNA表達量的測定

2.5.1 總RNA的提取 卵巢組織勻漿后，按照RNA 提取試劑盒(Promega)說明書抽提大鼠卵巢總mRNA。1%瓊脂糖凝膠電泳(80V/cm，30min)鑒定總RNA質量。

2.5.2 逆轉錄反應 按照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行反轉錄反應。(1)反應體系(20μL體系)：2μL總RNA，1μL Oligo(dT)18引物，9μL Rnase-free Water，4μL 5×Reaction Buffer，1μL RNA酶抑制劑，2μL 10mM dNTP Mix，1μL M-MulV反轉錄酶。(2)反應條件：65℃孵育5min，42℃孵育60min。70℃加熱5min終止反應。反轉錄產物-80℃保存。

2.5.3 熒光定量PCR反應 以β-actin基因為內參基因，對FSHR mRNA進行實時熒光定量PCR檢測。

2.5.3.1 引物設計與合成 NCBI檢索大鼠FSHR基因序列，用Primer Express 3.0軟件設計引物，由上海生工生物工程有限責任公司合成。引物序列如表1。

表 1 引物信息

2.5.3.2 PCR 過程 將總RNA 反轉錄獲得的cDNA 進行連續5倍濃度稀釋，以各稀釋度為模板進行實時熒光定量PCR，制作標準曲線和溶解曲線進行反應條件優化。(1)優化后的反應體系(10μL體系)：Maxima SYBR Green/ROX qPCR預混液5μL，上游引物(0.5μmol/L)0.5μL，下游引物(0.5μmol/L)0.5μL，cDNA(稀釋60倍)3μL， Rnase-free Water 1μL。(2)FSHR和β-actin優化后的反應條件：95℃預變性10min；95℃ 10s，60℃ 60s，72℃ 15s，40個循環。每樣本做4個復孔。

3 結果

3.1 對大鼠卵巢形態學的影響(肉眼觀) 模型組卵巢蒼白，表面見較少卵泡，且卵泡較?。桓饔盟幗M和正常組卵泡數目明顯多于模型組，卵泡明顯增大；尤以來曲唑組最為明顯，通高、中組和正常組次之。

3.2 對卵巢指數的影響 如表2。

表 2 各組大鼠卵巢指數的比較

由表1可知，與正常組卵巢指數比較，模型組明顯降低，組間差異有顯著統計學意義(P<0.01)；與模型組卵巢指數比較，通高組升高，組間差異有顯著統計學意義(P<0.01)，通中、低組和右歸丸組也有所升高，組間差異無統計學意義(P>0.05)，來曲唑組升高明顯，差異有顯著統計學意義(P<0.01)；通脈大生片各劑量組比較，以通高組卵巢指數升高幅度最大，組間差異無統計學意義(P>0.05)。

3.3 FSHR mRNA表達量 見表3。與正常組比較，模型組卵巢降低且差異有統計學意義(P<0.05)；各用藥組與模型組比較，通高組上調且差異有統計學意義(P<0.05)，通中組、來曲唑組均上調且差異有顯著統計學意義(P<0.01)，通低組、右歸丸組亦有所升高，差異無明顯統計學意義(P>0.05)；通脈大生片各劑量組比較，通高組、通中組上調的幅度明顯高于通低組，其中尤以通中組上調幅度最為顯著。

表3 各組大鼠卵巢組織FSHR mRNA相對表達量的比較

3.4 卵巢重量與卵巢FSHR mRNA表達量的相關性分析 如圖1。

圖1 卵巢重量與卵巢FSHR mRNA表達量的相關性

由圖1可知，經Pearson相關分析，結果表明大鼠卵巢指數與卵巢FSHR mRNA表達量存在統計學弱正相關性(P<0.01，r=0.455)。

4 討論

《素問·上古天真論》曰：“女子二七，天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子?！敝嗅t認為“腎藏精，主生殖”，腎與天癸、沖任、胞宮密切相關。腎精充盛，則卵子發育成熟，腎陽鼓動，則沖任氣血調暢，從而促進成熟卵子的排出。故排卵障礙多責之于腎虛沖任失調。中醫臨床針對排卵障礙多從溫腎益精，調補沖任論治?！把a腎調沖法”作為中醫治療排卵障礙型不孕的治療大法，在臨床療效中表現明顯的優勢。

通脈大生片是根據四川名老中醫卓雨農自制方“通脈大生丸”研制的院內制劑，臨床用于治療婦科疾病60多年，尤其在治療無排卵性功血和排卵障礙型不孕方面取得了肯定的療效。方由17味中藥組成，包括杜仲、續斷、菟絲子、桑寄生、山藥、肉蓯蓉、當歸、枸杞子等。諸藥配伍共湊補腎養肝，調補沖任，和血通脈之效，因此該方是以補腎調沖為治療大法的典型方劑之一?，F代醫學研究發現，鹿角膠、桑寄生具有抗氧化抗衰老的作用。菟絲子和續斷中均含有黃酮類成分，具有促排卵的作用，其改善腎虛排卵障礙的物質基礎可能基于其主要成分黃酮的作用[5]，為菟絲子溫補腎陽的中醫功效提供了科學依據。韋敏等報道[6]，枸杞中的多糖成分對自然衰老雌鼠卵巢有保護作用，其機制與影響性激素和IGF-β的分泌有關。當歸有降低大鼠纖維蛋白原的作用[7]，可能通過影響卵巢局部血液流變學指數調節卵巢功能。這些單味藥藥物成分和功效的實驗研究均為通脈大生片治療排卵障礙型不孕提供了佐證。

FSHR屬于G蛋白偶聯型受體家族中的成員。FSH調節卵巢功能和卵泡發育功能的發揮必須通過卵巢顆粒細胞的FSHR所介導[8]。Abdennebi等人研究發現[9]，FSH的功能受FSHR表達數量或活性的調控。FSHR表達的增加可以改善卵巢對促性腺激素(Gn)的反應性，使卵泡數目和血清雌二醇峰值增加，可能會取得更好的排卵效果[10-12]。因此FSHR表達量對卵泡的發育有重要的促進作用。

現代醫學研究報道卵巢排卵功能受下丘腦-垂體-卵巢生殖軸的調控，但越來越多的實驗研究證實卵巢排卵還受自分泌-旁分泌因子的微調節[13,14]。有研究認為TGF-β超家族成員在卵泡發育的各個階段有重要的作用[15]。更有研究證實TGF-β參與卵巢顆粒細胞FSH受體表達的上調[16,17]。

課題前期實驗研究已經證實通脈大生片促卵泡發育和排卵的功效不僅調控下丘腦-垂體-卵巢生殖軸[18]有關，還與調控TGF-β/Smads信號轉導通路有相關性，對腎虛排卵障礙型不孕具有肯定的治療功效。研究結果顯示TGF-β1與其受體在通脈大生片灌胃后的大鼠中表達量均上調[19,20]。用通脈大生片灌胃后大鼠卵巢超微結構發現模型組卵巢數目少，卵巢顆粒細胞稀疏，層次明顯減少，大量閉鎖卵泡和原始卵泡存在。而通脈大生片高、中、低劑量組卵巢卵泡顆粒細胞較模型組致密增厚，層次明顯，有成熟卵泡形成。并且通脈大生片各劑量組血清FSH、LH數目也較模型組增多，表明通脈大生片可通過提高FSH、LH的分泌，調節卵泡的發育和卵巢排卵功能。

本實驗選用丙酸睪酮復制腎虛排卵障礙型不孕模型。注射丙酸睪酮后的大鼠不僅出現陰道脫落細胞的病理改變，而且還表現出脫毛，驚恐易激惹行為。中醫認為腎其華在發，在志為恐。腎精充，則毛發榮，情志和。腎精虧虛，則毛發枯槁，因虛致恐。中醫理論在模型大鼠癥狀表現中得到印證，為中醫科學化提供了研究思路。病、證結合是研制中醫疾病、病理模型的最佳途徑。丙酸睪酮制備的腎虛排卵障礙型不孕模型不僅排卵障礙的指標變化，還有“腎虛”體征。該模型是既與中醫基礎理論相吻合，又與中醫臨床實踐相吻合的實用性動物模型，“病”、“證”結合，科學規范。

在前期實驗基礎上，本研究結果發現用通脈大生片灌胃后的卵巢FSHR的表達量明顯上調，大鼠卵巢重量也明顯較模型組增加，卵巢FSHR mRNA的表達量與卵巢指數之間存在一定的相關性，表明通脈大生片可提高卵巢組織FSHR mRNA的表達量，提高卵巢對FSH的反應敏感性，從而促進卵泡的發育和卵子的排出。因此，本實驗得出結論，通脈大生片促進腎虛ASR大鼠的卵泡發育及排卵的機制可能與通過上調卵巢局部FSHR mRNA的表達，提高卵巢對FSH反應性有關，為補腎調沖法治療腎虛排卵障礙型不孕提供了科學依據。至于FSHR mRNA表達的上調是否基于TGF-β1/Smads信號轉導通路的調控而實現有待后期實驗進一步研究。

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