大黃酚對腦缺血再灌注小鼠肺組織過氧化氫和過氧化氫酶的影響※

王四海 郭 楨 張秀敏 韓培天 溫塘芳 王 樹

(河北北方學院附屬第二醫院心胸外科，河北 宣化 075100)

大黃酚對腦缺血再灌注小鼠肺組織過氧化氫和過氧化氫酶的影響※

王四海 郭 楨1張秀敏 韓培天 溫塘芳 王 樹2

(河北北方學院附屬第二醫院心胸外科，河北 宣化 075100)

目的研究大黃酚(chrysophanol，Chry)對腦缺血再灌注(IR)后小鼠肺組織中過氧化氫(H2O2)及過氧化氫酶(CAT)的影響，探討大黃酚對腦IR后對肺損傷的保護作用機制。方法取昆明種小鼠80只，3.5%水合氯醛麻醉后，制備小鼠IR模型。將造模成功的74只小鼠隨機分為5組，藥物組(IR+Chry)45只，分為高、中、低劑量3個組，各15只，模型組15只，假手術組14只。藥物組于缺血前30min 分別腹腔注射大黃酚10.0、1.0、0.1mg/kg；模型組于缺血前30min 腹腔注射溶劑10mL/kg；假手術組只進行手術，但不進行腦IR，腹腔注射溶劑10mL/kg。模型組和藥物組小鼠恢復血供后10min快速斷頭處死，取肺組織，制成10% 肺組織勻漿，測定小鼠肺組織中H2O2含量和CAT活力。結果與假手術組比較，模型組小鼠肺組織內H2O2含量明顯增加(P<0.05)，肺組織內CAT活力明顯降低﹙P<0.05)；與模型組比較，高劑量大黃酚組小鼠肺組織內H2O2含量明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，高劑量大黃酚組小鼠肺組織內CAT活力明顯提高(P<0.01)。結論大黃酚對腦IR肺損傷的保護作用可通過提高肺組織中CAT活力起作用。

腦缺血再灌注；肺臟損傷；過氧化氫；過氧化氫酶；大黃酚

大黃酚(chrysophanol，Chry)為大黃的有效成分之一，有研究表明Chry對腦缺血再灌注(IR)所致小鼠記憶功能損傷有明顯的保護作用[1]，但關于Chry對腦IR引起肺損傷的保護作用報道少見。我們擬通過采用小鼠短暫性腦缺血模型觀察Chry對腦IR后小鼠肺組織中過氧化氫(H2O2)含量及過氧化氫酶(catalase，CAT)活力變化的影響，探討Chry對腦IR所致肺損傷的保護作用機制，為其應用于臨床治療腦血管疾病引起的肺組織損傷的保護作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 動物 昆明種小鼠80只，體質量 (28±2)g，雌雄不拘，中國醫學科學院北京藥物研究所提供，許可證號：(京)2004200012。

1.1.2 藥物與試劑 大黃酚(中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%，批號110796-200412)，實驗前用N，N-dimethyl-Formamide溶解，聚山梨酯-80助溶，0.9%氯化鈉注射液稀釋至所需濃度。N，N-dimethyl-Formamide∶聚山梨酯-80∶0.9% 氯化鈉注射液為1∶1∶8。CAT可見光試劑盒及H2O2試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 儀器 FSH-2內切式組織可調高速勻漿器(江蘇大地自動化儀器廠)；LabTech全自動紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；二列六孔電熱恒溫水浴鍋(北京精科華瑞儀器有限公司)；Sigma3K30高速冷凍離心機(德國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 3.5%水合氯醛(10mL/kg，腹腔注射)麻醉小鼠，仰臥位固定，自胸骨柄到下頜骨間行5～8mm正中縱向切口，分離兩側頸總動脈，分離后用液體石蠟浸泡過的黑色手術線穿過左右二側頸總動脈，盡量恢復兩側頸總動脈到原位，黑色手術線在氣管上方打松反手結，結的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側頸總動脈上方的黑線上穿過一條用液體石蠟浸泡過白色手術線，按文獻[2]方法埋線后縫合切口。術后48h將頸下部黑色手術線拉緊，阻斷兩側頸總動脈造成大腦缺血狀態，5min后輕拉兩側白色手術線，使頸總動脈恢復血液再灌注[1]。

1.2.2 實驗分組 造模成功74只，術后48h將清醒、活動正常的造模成功的74只小鼠隨機分為5組，藥物組(IR+Chry)45只，分為高、中、低劑量3個組各15只，于缺血前30min 分別腹腔注射大黃酚10.0、1.0、0.1mg/kg；模型組15只，于缺血前30min 腹腔注射溶劑10mL/kg；假手術組14只，進行手術，但不進行腦IR，腹腔注射溶劑10mL/kg。

1.2.3 小鼠肺組織內H2O2含量及CAT活力的測定 模型組和藥物組小鼠恢復血供后10min快速斷頭處死，在0.9%氯化鈉注射液冰塊上迅速取肺組織，4℃ 0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干，置于1mL離心管內，并置于Forma-86c ULT 冰柜內冷凍貯存。實驗時取出制成10% 肺組織勻漿，3500～4000r/min，-4℃低溫離心10min后取適量上清液測定H2O2含量和CAT活力。每mg組織蛋白每s分解1μmol的H2O2的量為一個CAT活力單位。

2 結 果

2.1 各組肺組織中H2O2含量比較 見表1。

組 別n劑量(mg/kg)H2O2假手術組14-39．1±9．8模型組15-51．0±10．2?高劑量大黃酚組1510．022．3±6．7△中劑量大黃酚組151．049．2±10．2低劑量大黃酚組150．150．8±13．1

與假手術術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01

由表1可見，與假手術組比較模型組小鼠肺組織內H2O2含量明顯增加，差異有統計學意義﹙P<0.05)；與模型組比較高劑量大黃酚組小鼠肺組織內H2O2含量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 各組肺組織中CAT活力比較 見表2。

組 別n劑量(mg/kg)CAT假手術組14-10．5±4．2模型組15-6．3±3．1?高劑量大黃酚組1510．011．5±5．0△中劑量大黃酚組151．05．4±4．1低劑量大黃酚組150．16．1±1．5

與假手術術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01

由表2可見，與假手術組比較模型組小鼠肺組織內CAT活力明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較高劑量大黃酚組小鼠肺組織內CAT活力明顯提高，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

在IR的臨床治療過程中，患者在接受治療后缺血的腦組織得到再灌注，可引起能量代謝障礙及缺氧，導致神經元缺血性死亡。腦缺血和缺血性再灌注可引起胞內Ca2+超載、細胞膜功能受損，毒性自由基產生，腦能量耗竭，興奮性氨基酸(EAA)釋放增加及細胞腫脹、凋亡和壞死等。腦IR導致的腦組織缺血、缺氧可引起缺血期原發性損傷及再灌注期繼發性損傷[3]。尋找有效的腦缺血疾病預防和治療藥物，在病理早期防治損傷進一步擴大，是當今國內外腦缺血疾病治療學研究的重點課題。

IR會嚴重影響肺功能，甚至引起肺功能障礙，再灌注損傷發生的病理生理基礎是缺血、缺氧，由此啟動腫瘤壞死因子(TNF)、花生四烯酸代謝產物如血栓素A2(TXA2)、白三烯B4(LTB4)等以及超氧化基團(ROIs)等因子合成和釋放的增加。這些因子除獨立發揮各自生物學功能外，還可相互影響、互為因果，引起血小板、白細胞聚集、脫顆粒及生物膜磷脂過氧化反應，大分子物質降解，釋放血管活性物質，增加血管通透性，升高肺血管阻力。參與再灌注損傷的這些因子將炎癥、活性氧基團及排異反應融合貫穿在一起，缺血再灌注對肺功能的影響，也是這3個主要方面共同作用的結果。因此，對IR損傷病理過程的研究和認識，有利于采取和加強針對性預防措施，提高肺保護質量，為改善肺功能提供可靠的保證。

CAT是H2O2催化分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化物體內。H2O2是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%。H2O2是活躍的強氧化劑，能通過氧化反應破壞細胞新陳代謝產生一系列新的氧化性活躍物質—自由基，而CAT是細胞內抗氧化酶，能夠消除細胞新陳代謝的副產物— H2O2。本研究結果表明，Chry可增強腦IR小鼠肺組織中CAT活性，促進H2O2分解，減少肺組織中H2O2含量，進而減少氧自由基的生成及脂質過氧化反應，提示Chry可減輕氧自由基對細胞的損傷，提高機體抗氧化酶的活性。有學者研究后認為，Chry對離體小鼠過氧化脂質有明顯的抑制作用[4]，進一步提示Chry減少自由基對肺組織損傷、增強肺組織中CAT活力是其保護腦IR引起肺損傷的重要機制之一。

[1] 王樹，張丹參，張力，等.大黃酚對腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護作用[J].中國老年學雜志，2009，29(15)：1934-1936.

[2] Himori N，Watanabe H，Akaike N，et al.Cerebral ischemia model with conscious mice：involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability[J].J Pharmacol Meth，1990，23：311-327.

[3] 韓敏，劉艷凱，薛茜.腦缺血再灌注損傷的研究進展[J].河北北方學院學報：醫學版，2006，23(5)：75-78.

[4] 李超，張丹參，趙曉倩，等.三種大黃酚制劑改善腦缺血/再灌注小鼠記憶功能的實驗篩選研究[J].中國藥理學通報，2010，26(12)：1607-1612.

(本文編輯：董軍杰)

Effectsofchrysophanolonhydrogenperoxideandcatalaseinlunginjuryinducedbycerebralischemiareperfusionofmice

WANGSihai*,GUOZhen,ZHANGXiumin,etal.

*DepartmentofCardiothoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Hebei,Xuanhua075100

ObjectiveTo study the effects of chrysophanol on hydrogen peroxide and catalase in lung injury induced by cerebral ischemia reperfusion in mice and further analyze the related mechanisms of protective effect on lung injury induced by cerebral ischemia reperfusion.MethodsCerebral ischemia reperfusion models of mice were prepared with 90Kunming mice anesthetized by 3.5% chloral hydrate.The models of 74mice that prepared successfully were randomly divided into five groups: sham-operated group(14mice, operate but not do cerebral ischemia reperfusion ), model group(IR, 15mice, operate and do cerebral ischemia reperfusion), high dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 10mg/kg), middle dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 1mg/kg), low dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 0.1mg/kg).Mice of model group and chrysophanol group were beheaded quickly when blood flow is restored after ten minutes, and then lung tissues were taken out of beheaded mice to make 10% lung homogenate.H2O2and CAT activities in lung were measured.ResultsCompared with sham-operated group, the content of H2O2of model group was increased, and the activities of CAT was decreased, and there were statistical differences﹙P<0.05)；Compared with model group, Chrysophanol could decrease the content of H2O2(Chry10.0, Chry1.0mg/kg，P<0.01)and increase the activities of CAT(Chry10.0mg/kg，P<0.01) in lung of mice induced by cerebral ischemia reperfusion.ConclusionProtective effects of chrysophanol on lung injury of cerebral ischemia reperfusion can be affected by increasing the activity of CAT in the pulmonary tissue.

Cerebral ischemia reperfusion；Lung injury；Hydrogen peroxide；Catalase；Chrysophanol

※ 項目來源：張家口市科學技術研究與發展指導計劃項目(編號：1221015D)

王四海(1970—)，男，副主任醫師，碩士。從事多器官損傷保護研究工作。

R-332；R284.1；R563.02；R619.901

A

1002-2619(2014)10-1546-03

2014-05-13)

1 河北省宣化縣新型農村合作醫療管理辦公室，河北 宣化 075100

2 河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000