血紅素加氧酶-1啟動子基因多態性與食管鱗癌的相關研究

王獻偉 黃金娜 王愛玲 李延峰 解俊霞

·論著·

血紅素加氧酶-1啟動子基因多態性與食管鱗癌的相關研究

王獻偉 黃金娜 王愛玲 李延峰 解俊霞

目的探討血紅素加氧酶-1(HO-1)基因啟動子序列的(GT)n雙核苷酸重復多態性與食管鱗狀上皮癌的關系。方法采用聚合酶鏈反應(PCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術在93例食管癌患者和98例正常對照人群中檢測HO-1基因多態性，比較基因型及等位基因在2組的分布。結果2組人群在年齡、性別比、血糖、血脂水平分布無明顯差異；重復 32次的長等位基因(L等位基因)的頻率在食管癌組要顯著高于對照組(26.9%比14.2%,P<0.05)。結論HO-1基因啟動子區域的(GT)n雙核苷酸重復多態性可能與食管鱗狀上皮癌的易感性相關。較長的(GT)n重復等位基因HO-1啟動子與食管鱗狀上皮細胞癌的風險，而較短(GT)n重復等位基因可能在食管鱗狀上皮細胞癌的發生起保護作用。

血紅素加氧酶；基因多態性；食管腫瘤

血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解代謝過程中的一種限速酶，HO的作用之一是可將血紅素分解為一氧化碳(carbon monoxide，CO)、Fe、膽綠素。HO-1的產生過程是一種對有害性刺激的適應性及保護性反應,并與臨床上某些相關疾病密切相關，在腫瘤細胞中普遍呈高表達狀態。近年來有研究表明，HO與腫瘤的增殖、血管發生和細胞凋亡等生物學行為密切相關。HO-1基因啟動子有一雙核苷酸(GT)n重復序列，具有較高的多態性，能影響其基因的轉錄活性。通過體外實驗測定(GT)n重復次數，能間接了解機體內HO-1的遺傳表達程度。較長的重復序列HO-1轉錄活性較低[1]，并且有報道較長的重復序列(GT)重復增加心血管疾病的易感性，導致慢性阻塞性肺疾病，肺腺癌口腔癌等[2]。我們對食管癌患者和健康對照者的血紅素加氧酶-1基因啟動子序列的(GT)n雙核苷酸重復多態性進行了對照研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本部分191例食管鱗癌患者中有完整病例資料，石蠟包埋組織塊(手術切除標本或活檢標本)及血樣標本的共93例。所有病例均為39歲以上，年齡39～75歲,平均58.5歲。所有病例臨床資料完整,按照WHO 2003年AJCC第六版PTNM分期標準食管癌分期，11期25例，三期33例,四期35例。無縱隔淋巴結轉移45例，有縱隔淋巴結轉移48例。高分化鱗中分化鱗癌42例，低分化鱗癌51例。對照組98例為同期所取經檢測為健康的標本。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取：采外周血2 ml(EDTA抗凝)，采用常規酚/氯仿法提取，用紫外光分光光度計檢測DNA的濃度和純度，DNA純度=A260/A280，比值結果范圍為1.6～1.8，說明樣品DNA雜質少，純度高；如果DNA純度<1.60，表明蛋白含量太高或者有殘存酚，需再提取純化。

1.2.2 HO-1基因啟動子區序列多態性分析：應用PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測HO-1基因啟動子區列GT重復數目。

1.2.3 PCR反應：①引物設計 (由上海生工生物工程公司合成)。上游引物P1：5’-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGA-3’下游引物P2：5’-ACAAAGTCTGGCCATAGGAC-3’②PCR反應體系：采用50 μl反應體系，每體系含ddH2O:36.5 μl;10×Buffer:5 μl;引物P1:1 μl;引物P2:1 μl;10 mmol/L dNTPs:1 μl;Taq酶：0.5 μl;基因組DNA2.0 μl。③PCR擴增條件：95℃變性30 s；55℃復性30 s；退火延伸72℃ 30 s，共31個循環。

1.2.4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳：用TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠。在微波爐內煮沸直至瓊脂糖溶解，待冷卻到60℃時，加入溴化乙錠(10 mg/ml)使其終濃度為0.5 mg/ml,混勻后灌膠。待膠凝固后放入含TAE電泳液的電泳槽內，使TAE液蓋過凝膠。取10～15 μl提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液(含0.25%溴酚蘭，4%蔗糖)按4∶1比例混勻后點樣。60 V電泳1 h。

1.2.5 染色及結果鑒定：電泳結束后，將凝膠取出，放入小托盤中，用全自動凝膠成像儀觀察梯形條帶，并攝影記錄各標本的基因型。

1.2.6 基因型的判定[3]：由于HO-1啟動子區基因多態性是由雙核苷酸(GT)重復序列的數目不同而引起，是一種長度重復的多態性，所以可以直接對其PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過捷達凝膠顯像系統來計算該電泳片段的總長度，除去固定堿基序列的數目，即能推算出雙核苷酸重復的數目。查閱Genebank Accession Nos AF145047.1核對HO-1基因啟動子區域基因序列發現兩引物之間共有127個序列5"-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGATTTCCTT’AAAGGTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAT；GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTCTCTAAA；AGTCCTATGGCCAGACTTTGT- 3’產物中GT重復兩端的固定序列長度為:127-(30×2)=67(bp)。這樣推算出，GT重復次數=(產物長度-67)/2。通過捷達凝膠顯像系統來計算其電泳片段的總長度，除去固定堿基序列的數目，依次來推斷雙核苷酸重復的數目。根據重復次數的差別分為三種序列：重復次數≤25者為小量重復序列(S型位點);重復次數處于26～30者為中量重復序列(M型位點)；重復次數大于或等于31則為大量重復序列(L型位點)?；蛐偷挠嬎悴捎弥苯佑嫈捣?，公式為等位基因頻率=(該基因純合子個體數×2+該基因雜合子個體數)/總個體數×2。

2 結果

2.1 2組間年齡、性別比較 2組間年齡經、性別構成經比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組各項一般臨床數據比較

2.2 HO-1基因PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后結果 因為劃分了三種等位基因S、M、L所以得到六種基因型。見圖1。

2.2.1 基因型分布 HO-1基因啟動子區(GT)n重復序列在對照組和食管癌組中的基因型分布差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2.2 HO-1等位基因在對照組和食管癌組的分布 食管癌組的L等位基因頻率要明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 各基因型及等位基因在對照組及食管癌組中的分布比較 根據各基因的電泳結果，計數其基因型。

1，7：marker；2～6：SL，SL， ML， ML，LL；8～11：SL，SS，SM，SM
Marker條帶從小到大依次為67、110、147、190、242、331、404、489、451、692、881

圖1 HO-1基因PCR產物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖像(10%)

表2 HO-1基因啟動子區在對照組和食管癌組的基因型分布 例

表3 對照組和食管癌組HO-1等位基因分布頻率比較 例(%)

3 討論

從我們的病例對照研究分析結果看,攜帶HO-1 L等位基因食管鱗癌的發病風險明顯高于對照組，差別是有統計學意義的。在這種本次對照研究中，我們發現了HO-1啟動子GT重復長度之間與食管鱗狀上皮癌的關系，尤其是GT重復大于31增加了患食管癌的風險，這表明，較短的GT重復等位基因可能對食管癌有保護作用。

消化道疾病中，HO-1的水平增加，并發揮其對消化道的積極作用，主要是抗炎抗氧化等細胞保護作用[2]。血紅素在HO-1的作用下，降解為一氧化碳(CO)、膽綠素和鐵，膽綠素隨后被還原為膽紅素。HO-1不僅在體內起到維持血紅素水平穩定的作用，HO-1酶促反應及其產物在人體內具有調節和保護作用。膽紅素和膽綠素在一定濃度下是內源性強抗氧化劑 具有抗氧化、抗脂質過氧化，保護細胞免受損傷及增強維生素C和維生素E抗氧化能力等作用。除此之外，膽紅素也被報道具有調節免疫反應和抑制炎癥反應的作用。許多研究證實膽紅素/膽綠素在許多病理條件下具有強大的細胞保護作用[4]。根據亞洲人的基因特點，HO-1基因啟動子序列(GT)n 重復次數值為10～39，22、29、33分別為其中的三個重復高峰，并且該研究還劃分了3個等位基因：S型位點n≤25; M型位點26～30;L型位點n≥31[5]。本研究發現L等位基因的頻率在食管癌組為26.9%明顯高于對照組14.2%，說明攜帶HO-1 L等位基因食管鱗癌的發病風險明顯高于對照組，相反較短的GT重復等位基因可能對食管癌有保護作用。

以往的研究表明，雖然HO-1啟動子多態性多態性可能會影響轉錄但對腫瘤的進展沒有影響，它可能排除HO-1的作用多態性作為腫瘤傳播的風險指標。本研究證實了HO-1基因啟動子區域的(GT)n長度重復多態性很可能是食管癌的易感基因，當然，要證實該結論還有待于提高樣本量來進一步研究。

總的來說，我們的線索表明，長GT重復等位基因HO-1啟動子和食管癌相關的風險。研究結果還表明，較短的GT重復HO-1啟動子等位基因可能在食管癌中的保護作用。

1 Kikuchi A,Yamaya M,Suzuki S,et al.Association of susceptibility to the development of lung adenocarcinoma with the heme oxygenase-1 gene promoter polymorphism.Hum Genet,2005,116:354-360.

2 Chang KW,Lee TC,Yeh WI,et al.Polymorphism in heme oxygenase-1 (HO-1) promoter is related to the risk of oral squamous cell carcinoma occurring on male areca chewers.Br J Cancer,2004,91:1551-1555.

3 劉智賢.HO-1啟動子區基因多態性與高血壓和冠心病的相關性研究.天津醫科大學.2008.

4 Sawle P，Hammad J，Fairlamb I J，et al．Bioactive properties of iron-containin g carbon monoxide-releasing molecules(CO-RMs).J Pharmaeol Exp Ther,2006，318：403.

5 Fu WP,Zhao ZH,Fang LZ,et al.Heme oxygenase-1 polymorphism associated with severity of chronic obstructive pulmonary disease.Chin Med J (Engl),2007,120:12-16.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.009

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：20120447)

050011 河北省石家莊市第一醫院(王獻偉、王愛玲、李延峰)；河北省醫學情報研究所(黃金娜、解俊霞)

R 735.1

A

1002-7386(2014)05-0668-03

2013-12-11)