時間分辨免疫熒光法用于梅毒抗體測定的探討

廖 群,劉小玲,郭 惠

(重慶市急救醫療中心 檢驗科,重慶400014)

梅毒螺旋體屬于密螺旋體屬蒼白螺旋體中的蒼白亞種[1]，是由梅毒螺旋體引起的一種慢性的，系統的傳染性疾病，對健康危害程度僅次于艾滋病，幾乎可以累及全身各個器官，導致功能障礙。梅毒的傳播途徑大多數通過性接觸傳播亦通過血液和垂直傳播，是傳染性極強的疾病，近年來梅毒在我國的發病率明顯增大，其流行對人類的健康形成了嚴重威脅，也給社會造成了巨大壓力。梅毒的早期診斷與防治也成為十分重要的社會和醫學問題。2004年12月1日起施行的傳染病防治法中將梅毒列為乙類傳染病，梅毒的相關血清學檢驗是目前規定的手術、輸血(供、受血者)及各種創傷性檢查的患者必須進行的檢測項目之一[2]。目前血清學試驗是實驗室診斷梅毒的主要方法，在梅毒的診治及研究方面均有重要意義。選擇有效的檢測方法對梅毒早發現、早診斷、早治療及正確評價疾病、控制疾病的蔓延有著重大意義。

臨床上血清試驗主要分為兩大類：一類為非TP抗原血清學試驗如RPR、TRUST等，主要檢測梅毒患者血清中非特異性的類脂質抗體；另一類為TP抗原血清學試驗如TPPA，還有ELISA、金標法等。長期以來國內外都在不斷探討更靈敏的梅毒血清學檢測技術，近年來時間分辨熒光分析法(TRFIA)的應用使梅毒抗體的檢測上了一個新臺階。本實驗運用時間分辨熒光分析法與傳統的血清學檢測方法TPPA、TP-ELISA比較，探討其在梅毒血清學診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1樣本來源血清標本選擇來自本院2012年1月至2012年7月門診患者共計256份。采集靜脈血及時離心分離血清，置-20℃冷凍保存；2NICU及1NICU的梅毒質控血清由康徹斯坦提供。

1.2試劑TRFIA試劑盒由蘇州新波生物技術有限公司提供，試劑批號2012052001；ELISA試劑盒由北京萬泰生物藥業股份有限公司提供，批號為N20121016；TPPA試劑盒由日本富士瑞比歐公司提供，批號VN30203。所有試劑均在有效期內使用。

1.3儀器芬蘭MK3酶標儀，恒溫水浴箱，新波洗板機，新波EFFICUTA全自動樣本前處理系統，新波ANYTST2000時間分辨熒光分析儀。

1.4檢測原理TRFIA：用基因重組抗原包被酶標板孔，與待檢血清反應后加入銪標記抗原，若存在梅毒抗體則可檢測到熒光信號，熒光值與抗體含量呈正比；TPPA：用經裂解的梅毒螺旋體為抗原，致敏經醛化，鞣化的羊或禽類紅細胞，該紅細胞可與待檢樣本中的梅毒螺旋體抗體結合而出現凝集反應；ELISA：采用雙抗原夾心法，利用辣根過氧化酶和底物的結合后顏色變化，在酶標儀上進行檢測。

1.5方法

1.5.1 靈敏度、特異性測試 將256份標本分別用TRFIA、ELISA、TPPA三種方法進行檢測，統計結果。

1.5.2 精密度檢測 將高濃度病人標本混合稀釋配成高中低三個梯度標本用TRFIA法進行精密度實驗，批內精密度：用三個濃度標本重復測定20次。批間精密度：三個濃度標本每天測定一次，分別測20天，并對測定結果進行統計。

1.5.3 線性試驗 將不同濃度(1NICU、2 NICU)質控品分別作1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32倍稀釋，用TRFIA法進行檢測。

1.5.4 P50檢測 將質控標本一系列稀釋，用TRFIA法重復測定以確認獲得50%陽性及50%陰性結果的稀釋度。

1.5.5 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件進行統計學處理。

2 結果

2.1 診斷評價指標分析 以TPPA試驗為對照，對256份標本分別用TPPA，ELISA、TRFIA三種方法測定TP結果，計算靈敏度、特異性和結果符合率見表1。

表1 256例標本用三種方法測定TP結果比較

根據表1數據得出TRFIA與TPPA相比其靈敏度為100%，特異性為98.2%，符合率為98.4%。ELISA與TPPA相比其靈敏度為97%，特異性為94%，符合率為94.5%。

2.2 差異性檢驗 分別將TRFIA、ELISA法測TP特異性抗體的結果以TPPA檢驗結果為標準，分類進行兩兩χ2檢驗，以判斷兩種方法的差異有無統計學意義,見表2。

表2 配對χ2檢驗結果

由表2可得：TPPA和TRFIA、ELISA方法測定梅毒特異性抗體無統計學意義。

2.3 Kappa一致性檢驗 用SPSS10.0統計軟件對檢測結果進行Kappa一致性檢驗，結果見表3。

表3 不同檢測方法間Kappa一致性檢驗結果

僅僅用Kappa來判斷兩種方法的一致性是不夠的，還需要進一步用假設檢驗進行檢驗。只有在假設檢驗判斷具有一致性的基礎上評價一致性強度才有意義。不同檢測方法間假設檢驗結果見表4。

表4 不同檢測方法間假設檢驗結果

通過假設檢驗結果判斷：TRFIA法測TP特異性抗體與TPPA方法檢測結果一致，ELISA法測TP特異性抗體與TPPA方法檢測結果一致，但TRFIA法Kappa為0.93>0.75，表明與TPPA方法相比一致性優。ELISA法Kappa為0.72<0.75，表明與TPPA方法相比一致性一般。

2.4 結果的精密度 高中低三種濃度標本測定TP的批內、批間精密度結果見表5。

表5 TRFIA法的批內、批間精密度結果(n=20)

批內、批間精密度均<10%,表明精密度高、重復性好

2.5 線性試驗測試結果 質控1NCU、2NCU系列稀釋濃度值的變化結果見表6。

表6 TRFIA法測TP的1NICU、2NICU系列稀釋度、

注：△相關系數r=0.95，回歸方程y=0.1761x+0.0164,▲相關系數r=0.999，回歸方程y=0.237x-0.0909。相關系數均>0.9，說明相關性高

2.6 臨界濃度的檢測 將1NCU的質控品系列稀釋，在0.12NCU處用40份重復測定得到45%的陽性結果，55%的陰性結果。則判斷該濃度為臨界濃度P50。0.15NCU為最低檢出濃度P95，0.1NCU為P5。

3 討論

目前檢測梅毒血清學試驗的方法很多，其特異性、靈敏度、臨床價值有所不同[3-7]。TRFIA、TPPA、ELISA法均檢測的是梅毒IgM、IgG混合抗體，早期的IgM抗體和恢復期產生的IgG抗體均會使檢測結果為陽性。筆者通過對2012年1月至2012年7月我院256名門診患者(主要來自于皮膚研究所、婦產科)的梅毒血清學試驗結果進行統計分析，發現TP-ELISA法檢測陽性率為18.7%，與文獻報道接近[8]。通過ELISA、TPPA、TRFIA三種方法對256例血清標本進行TP檢測結果比對，ELISA方法檢測有48例陽性，陽性率18.7%，TRFIA法39例陽性，陽性率15.2%，而金標準TPPA僅有35例陽性，陽性率13.67%。由此可見與TRFIA、TPPA相比，ELISA測定TP假陽性率相對較高，ELISA影響因素較多，如標本中一些血漿蛋白紊亂，類過氧化物酶樣物質的增高等均可造成假陽性。由于酶免疫法酶的抗干擾和靈敏度上比時間分辨法抗干擾的能力稍弱，容易受環境和血液是否溶血、黃疸等因素影響，而致假陽性情況出現，對臨床診斷有一定的誤導。TRFIA采用基因重組抗原包被酶標板孔，與待檢血清反應后加入銪標記抗原，若存在梅毒抗體則可檢測到熒光信號，熒光值與抗體含量呈正比。由于采用震蕩反應并適當延長孵育時間更有助于提高靈敏度，降低本底[9]。本文結果表明TRFIA法最低檢測濃度為0.15NCU。TRFIA分析系統采用波長分辨、時間分辨和1000次均值等方法，提高了系統的靈敏度和特異性，真正實現了零本底測量提高了檢測精度[10-11]。與經公認的梅毒血清確證試驗[12]TPPA法相比，TRFIA特異性98.2%，靈敏度100%，符合率98.4%,Kappa值0.936，說明TRFIA法具有較高的靈敏度和特異性，與TPPA法相比有很高的一致性。時間分辨免疫熒光技術具有重復性好，批內變異<8%,批間變異<15%表明其精密度、穩定性好。而采用時間分辨熒光分析法全自動樣本前處理系統EFFICUTA進行自動加樣，可避免造成人為的誤差。ELISA與TPPA相比其靈敏度為97%，特異性為94%，符合率為94.5%。ELISA法Kappa為0.72<0.75，表明與TPPA方法相比一致性一般。

時間分辨法可克服酶免和TPPA試劑在環境和血液狀態的干擾。雖然有大量資料[13，16]顯示ELISA方法敏感性、特異性都較高，但與TRFIA相比，TRFIA的靈敏度、特異性均高于ELISA法。因此TRFIA更適合作為梅毒的初篩實驗。雖然ELISA方法也是檢測的梅毒特異性抗體，且操作簡單，應用酶標儀進行結果判斷，客觀準確，原始資料也容易保存，是目前臨床普遍用于梅毒大批量篩查的方法，由于目前國內各試劑廠家采用的基因重組抗原不同，免疫組份的表達抗原組合含有一些非特異性反應物質使ELISA法存在難以回避的一些致假陽性因素。某些與人類共生的螺旋體也可與ELISA試劑盒中包被的抗原發生交叉反應，使標本中的一些類過氧化物酶樣物質的增高和血漿中的蛋白紊亂等引起假陽性結果。TPPA法是目前普遍采用的梅毒抗體確證試驗，但試劑成本較高，檢測時需將標本作系列稀釋，不利于大批量標本檢測。TPPA試劑的致敏顆粒溶解后，保存時間較短，約為5天左右，放置時間較長后，吸附在致敏顆粒上的抗原性物質易脫落而致假陰性的出現，以及出現溶血和黃疸現象時，很難通過肉眼觀察是否發生凝集，且以肉眼判斷結果，原始數據無法保存。不適用大批樣本篩查。時間分辨熒光分析技術具有重復性好，標記物存儲時間長等優點[17]，在高、中、低濃度的批內、批間變異系數均小于10%，提示系統精密度高。在線性試驗時1NICU和2NICU系列稀釋后測定結果表現出了較高的線性相關，分別為0.999和0.95，表明相關系數、回歸方程均表現出良好等線性。與金標準TPPA相比，靈敏度為100%，特異性為98.2%，符合率為98.4%，表明兩者相關性好。兩者比較P>0.05,Kappa值為0.93，說明TPPA和TRFIA兩種方法測定梅毒特異性抗體結果無統計學意義，一致性好。而其最低檢測濃度為0.15NCU，降低了假陰性的風險。

綜上所述，用時間分辨熒光免疫分析法檢測梅毒非特異性抗體具有靈敏度高、特異性強、所用試劑有良好的穩定性、檢測限較寬、檢測能力強，與TPPA相關性好。尤其是能消除常規熒光測定中的高背景等優點，是非放射免疫分析中很有發展潛力的分析方法。全自動樣本前處理系統EFFICUTA進行加樣自動加樣，避免了人為誤差，是穩定可靠地常規特異性梅毒抗體檢測方法，采用計算機控制自動化操作系統，結果判定準確、原始數據容易保存等優點。與TPPA是彼此確認和復核的最佳選擇。尤其適合臨床進行大批量的篩查實驗。

參考文獻：

[1]程茂良，周仁芳，王 玨，等.3種不同梅毒抗體檢測方法在臨床中的應用價值[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(10):1255.

[2]顧友祥，姜 俊.多種梅毒抗體檢測方法的比較[J].檢驗醫學與臨床，2012,9(4)：391.

[3]Egglestone S.I.,Turner A J.Serological diagnosis of syphilis,PHLS Syphilis Serology Working Group[J].Commun Disease Public Health,2000,3(3)：158.

[4]王 華，李代渝，雷麗明.梅毒螺旋體血清學檢測方法比較[J].中華醫學檢驗雜志，2007.30(6):660.

[5]何壽國，黃進梅.三種梅毒血清學檢測方法的比較與應用評估[J].國際檢驗醫學雜志，2008,29(4)：384.

[6]陸東學，張銀輝，黨倩麗,等.梅毒實驗室診斷與評價[J].中華醫學檢驗雜志，2005,28(12):1262.

[7]劉建華.4種梅毒螺旋體檢測方法的臨床評價[J].國際檢驗醫學雜志，2010,31(9)：1031.

[8]羊 建，唐明霞.不同梅毒螺旋體抗體檢測方法的臨床應用評價[J].國際檢驗醫學雜志，2011,32(9)1579.

[9]額爾敦，其其格，郭美香，等．雙抗HBsAg抗體夾心法時間分辨免疫熒光分析方法的建立[J].中國免疫學雜志，1999,15:508.

[10]王世真.分子核醫學[M].北京：中國協和醫科大學出版社，2001:163-169.

[11]秦衛仕，田 蓉，匡安仁.中國分辨熒光分析和放射免疫分析測量精度的比較[J].同位素，2002,15(2)：115.

[12]李鳳玉，黃建城.多種梅毒檢測方法的比較[J].中國醫藥指南，2012,10(17):125.

[13]李如林，張 潔,張小艷，等.ELISA、流式微球載體技術和膠體金滲濾法檢測梅毒抗體的比較及評價[J].細胞與分子免疫學雜志，2013,29(2)：201.

[14]候廣安.兩種梅毒抗體檢測方法檢出率不同的探討[J].成都醫學院學報，2012,7(3z)：461.

[15]鄒享珍.三種不同梅毒抗體檢測方法在臨床中的應用[J].實用醫學雜志，2007,23(5)：741.

[16]鄒先瓊，李曉敏.三種梅毒抗體檢測方法結果分析[J].中華實驗和臨床感染病雜志，2010,4(3):40.

[17]文 斌，陶其敏.自動化免疫分析的進展[J].中華醫學檢驗雜志，1996.19(4):329.