銅綠假單胞菌的臨床分布及對環丙沙星耐藥機制的研究

黃興富,范 華

(聊城市東昌府人民醫院 檢驗科,山東 聊城252000)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PAE)是一種常見的革蘭氏陰性桿菌,可存在于人體皮膚、呼吸道、消化道等部位,是臨床最常見的條件致病菌[1]。由于抗生素及免疫抑制劑等藥物的濫用,易引發機體菌群失調,導致銅綠假單胞菌感染致病；同時增強了病原菌的耐藥性,使得臨床治療困難重重。了解銅綠假單胞菌的臨床感染分布及耐藥性特點可以更好的指導臨床合理用藥,控制醫院感染。本研究對我院2011年9月-2013年9月收集的287株銅綠假單胞菌陽性標本的分布及耐藥情況進行分析,并初步探討了銅綠假單胞菌對環丙沙星抗菌藥物的耐藥機制,以期對臨床合理用藥提供一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1菌株來源收集了2011年9月-2013年9月我院各種臨床樣本分離的銅綠假單胞菌共287株。全部菌株通過法國梅里埃公司VITEK-32細菌鑒定儀進行鑒定。

1.2藥敏試驗采用瓊脂紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗,結果以美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)公布的標準判定。并采用微量肉湯稀釋法測定環丙沙星對PAE的最低抑菌濃度(MIC)。M-H瓊脂及抗菌藥物紙片均是英國Oxoid公司產品。以標準質控菌株銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)作為質控菌株。

1.3基因突變分析對gyrA、gyrB、parC及parE基因喹諾酮類耐藥決定區(QRDR)的突變進行檢測。采用煮沸法提取細菌總的DNA作為PCR模版。PCR反應條件為:94 ℃預變性5 min、94 ℃變性45s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,25個循環、72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。gyrA、gyrB、parC及parE特異性引物的合成及PCR產物的測定均由生工生物工程(上海)有限公司代為完成,所設計的引物序列如下：gurA上游：ATCACTACGGTGGCTCATTT,下游：CTTCGGTACCGTGAAGAAGA,擴增片段長度為910 bp；gyrB上游：GAAGTTCACTTCAAGCCGTC,下游：AGGAGAGCATCTTGTCGAAG,擴增片段長度為895bp；parC 上游：TCCAAAGTTCGCGGAATCCA,下游：ATCACTTAACCGGCTGGACG,擴增片段長度為398 bp；parE上游：GCATCCGCGAGGATACAGAT,下游：AGTCGGTGCAGGAAAGCTAC,擴增片段長度為691 bp。基因組提取試劑盒購自北京TIAGEN生化科技有限公司；PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.4統計分析采用SPSS16.0軟件進行數據統計分析。

2 結果

2.1臨床標本來源及科室分布287株銅綠假單胞菌的標本主要來源是痰液,共219例,占76.3%；其它標本依次為膿液22例,占7.7%；分泌物18例,占6.3%；尿液13例,占4.5%；血液8例,占2.8%；其他標本7例,占2.4%。而在臨床科室中的分布ICU和呼吸內科依然是銅綠假單胞菌感染最多的2個科室,分別占29.3%和22.6%,在其他科室分布依次為心內科40株,占13.9%；骨科23株,占8.0%；神經內科18株,占6.3%；腦外科17株,占5.9%；腎內科14株,占4.9%；消化內科10株,占3.5%；血液科7株,占2.4%；其他科室9株,占3.1%。

2.2耐藥性分析287株銅綠假單胞菌對7種臨床常用抗菌藥的耐藥性分析見表1。銅綠假單胞菌對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦及頭孢他啶敏感率均在70%以上；其次較為敏感的為氨曲南及頭孢吡肟,敏感率在60%以上；而對環丙沙星耐藥率較高,達44.9%,對氨芐西林的耐藥率甚至高達97.9%。

表1 287株銅綠假單胞菌對7種抗菌藥的耐藥性分析

2.3基因突變檢測對129株環丙沙星耐藥的銅綠假單胞菌進行MIC檢測,發現MIC≥32 μg/ml的菌株有45株,對此45株銅綠假單胞菌的gyrA、gyrB、parA及parE的QRDR進行PCR擴增及測序,結果發現,僅3株無任何基因突變,剩余42株均存在gyrA基因突變,且其中32株存在著雙突變,以gyrA基因和parC基因同時突變最多,有28例。詳見表2。

表2 45株環丙沙星耐藥銅綠假單胞菌的QRDR錯義突變分析

3 討論

銅綠假單胞菌是目前醫院感染常見的條件致病菌,可導致呼吸道、泌尿道和血液的感染[2-3],在醫院感染占有重要地位[4],且其感染率近年來不斷增加[5]。分析本院2011年9月-2013年9月收集的各科室共287株銅綠假單胞菌的臨床分布及耐藥情況,標本來源從多到少依次為痰液、膿液、分泌物、尿液和血液,其中痰液占了標本總數的76.3%。銅綠假單胞菌陽性標本的臨床科室分布以ICU(29.3%)及呼吸內科(22.6%)居多,其次為心內科(13.9%)及骨科(8.0%)等科室。考慮ICU及呼吸內科患者多為老年病人,患者病程長、病情重、機體免疫力低下,在對重癥患者進行搶救時常進行氣管切開及插管等侵入性操作,同時這些患者往往伴有長時間的使用廣譜抗菌藥控制感染,極易引發機體菌群失調進而導致條件致病菌如銅綠假單胞菌感染增加。

銅綠假單胞菌具有多種獲得性耐藥機制,并且具有耐藥性強和機制復雜的特性,同時也具有較強的環境適應能力[6]。本研究對7種臨床常用的抗菌藥耐藥性分析顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦及頭孢他啶敏感率均在70%以上；其次較為敏感的為氨曲南及頭孢吡肟；而對環丙沙星耐藥率較高,達44.9%,對氨芐西林幾乎全部耐藥。銅綠假單胞菌的耐藥機制復雜,主要涉及膜孔蛋白丟失、外排泵系統、整合子系統、基因盒和β-內酰胺酶等,導致臨床治療困難,目前抗菌藥應用廣泛,助長了細菌產生更強的耐藥性。本研究結果與國內一些報道相似[5-7],同時存在差異,郭麗等[8]研究分析顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率為39.8%,明顯高于我們的分析結果。碳青霉烯類抗菌藥物是治療銅綠假單胞菌的最有效藥物之一,亞胺培南為此類抗菌藥的代表性藥物,有研究顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率在逐年增加[9],高輝等[5]對某醫院2005年-2009年銅綠假單胞菌的耐藥性分析顯示5年內PAE對碳青霉烯類、β-內酰胺類、磺胺類、喹諾酮類等多種抗菌藥的耐藥性均有不同程度的增加趨勢。提示目前細菌耐藥問題日趨嚴重,臨床醫師應當合理用藥,規范用藥,防止細菌耐藥性持續升高。

由于銅綠假單胞菌對青霉素類藥物耐藥機制已相對明確,本研究僅對環丙沙星的耐藥機制進行初步研究。通過PCR擴增及測序的方法對目的菌株的gyrA、gyrB、parC及parE基因喹諾酮類耐藥決定區(QRDR)的突變進行檢測,在45株(環丙沙星MIC≥32 μg/ml)銅綠假單胞菌中,發現有42株均存在gyrA基因突變,且主要突變位點是第83位密碼子(ACC->ATC,Thr-83->Ile),說明了gyrA基因的錯義突變與對環丙沙星耐藥密切相關；而MIC范圍在128到256的銅綠假單胞菌株,大部分都存在gyrA與parC雙突變,從而說明parC基因突變能進一步提高銅綠假單胞菌對環丙沙星的耐藥性。但本研究未發現文獻報道的gyrA基因第87位密碼子單突變及83、87位密碼子雙突變菌株[10]。此外,還有3株銅綠假單胞菌未發現上述基因的QRDR錯義突變,提示銅綠假單胞菌對環丙沙星的耐藥情況還存在著其他機制,如主動外排系統的過度表達及膜滲透性的下降等。

細菌的耐藥性問題已成為我國顯著存在的醫療衛生及經濟性問題[11]。抗菌藥的不合理應用與菌株的耐藥性升高直接相關,這應引起各級醫師的高度重視,做到定期監測本地區常見病原菌的臨床分布和耐藥性變化,根據監測結果合理選用抗菌藥,更好的遏制菌株的耐藥率,提高治療療效。

作者簡介：黃興富(1976),男,學士,主管檢驗師,主要從事臨床檢驗工作。

參考文獻：

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[11]楊啟文,徐英春,謝秀麗,等.全國10所醫院院內與社區感染常見病原菌耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志,2009,19 (9):1133.