粘質沙雷菌β-內酰胺類耐藥基因研究

謝在海，朱元祺，李 莉，鄧乃梅，蘇維奇*

(1.龍口市人民醫院 輸血科，山東 龍口265000；2.青島大學醫學院附屬醫院 檢驗科，山東 青島266002；3.青島市市立醫院 a.檢驗科;b.醫院感染管理科， 山東 青島266011)

粘質沙雷菌廣泛存在于自然界的土壤、水、植物表面及食品中，由于該菌的毒力較低，以前被認為是非致病菌或機會致病菌。然而，近年來許多研究表明，該菌在機體免疫力降低、各種醫療處置以及生活環境不良的情況下，可引發感染和醫院內感染[1]。感染部位遍及機體各個系統，可引起呼吸道感染、泌尿道感染、創傷感染等多種疾病。近年來粘質沙雷菌的檢出率逐年增高，并且其耐藥性也有逐步升高的趨勢，在醫院感染中占有重要地位[2,3]。粘質沙雷菌的耐藥機制較為復雜，為調查該菌β-內酰胺類耐藥基因的攜帶情況，我們對臨床分離的287株粘質沙雷菌的耐藥表型進行分析，并對135株多重耐藥的粘質沙雷菌進行多種β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥基因進行檢測，以探討其耐藥機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源收集住院患者的痰液、創面分泌物、血液、尿液等各種感染性標本，按《全國臨床檢驗操作規程》(第三版)進行細菌培養，采用Vitek2-Compact全自動微生物分析系統進行菌種鑒定，使用板型為GNI，選擇粘質沙雷菌287株，同時對常用抗菌藥物進行MIC測定，使用板型為GNS，藥敏結果嚴格按照CLSI標準進行判讀，選出多重耐藥(同時對三類以上抗菌藥物耐藥)的粘質沙雷菌135株，質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌 ATCC 27853，統計學方法，采用WHONET5.6軟件進行統計分析。

1.2ESBLs檢測

參照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2010年推薦的ESBLs確認試驗標準[4]，在兩組藥敏紙片中，任一一組在加CA后抑菌圈直徑與不加CA的抑菌圈直徑≥5 mm時，判定為產ESBLs。

1.3三維試驗法檢測AmpC酶

1.3.1 AmpC酶表型篩選：根據2010年CLSI推薦的K-B標準[4]，采用頭孢西丁(30 μɡ)紙片擴散法篩選耐藥菌株，抑菌圈≤18 mm提示疑產AmpC酶菌株。

1.3.2 AmpC酶確認試驗：采用改良酶提取物三維試驗法進行AmpC酶確認試驗，參考文獻[5]進行。

1.4PCR模板提取挑取新鮮菌落少許置入100-200 μl純水中，沸水浴20 min后，10 000 rpm離心5 min,吸取上清液，并用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度及純度，合格后置于-20℃保存備用。

1.5耐藥基因檢測均為聚合酶鏈反應(PCR)法，15種β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥相關PCR擴增引物序列見表1。

1.6PCR擴增基因PCR擴增反應體系為50 μl，其中2.5 μ/μl Taq 0.5 μl,10×buffer 5.0 μl,25 mmol/L MgCL 2.5 μl，DNA 5 μl,dNTP 0.5 μl,Primer 0.5 μl,雙蒸水16.8 μl。反應條件94℃ 5 min，36℃ 5 min，72℃ 5min循環5次，94℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min循環30次，72℃延伸10 min。PCR反應產物在1.5%瓊脂糖凝膠上100V電泳40min后使用凝膠成像系統觀察DNA條帶分布并對其基因型進行分析。

表1 各種PCR引物序列及擴增片段長度

2 結果

2.1藥敏試驗結果藥敏結果顯示，粘質沙雷菌對美羅培南、舒普深和亞胺培南的耐藥率較低，而對氨芐西林、哌拉西林和頭孢曲松等臨床常用抗菌藥物的耐藥率較高，見表2。

2.2粘質沙雷菌的產酶情況在287株粘質沙雷菌中，共有32株產ESBLs，檢出率為11.1%，產AmpC酶44株，檢出率為15.3%，同時產ESBLs和AmpC酶細菌16株，占5.6%。

2.3耐藥基因檢測結果在135株多重耐藥的粘質沙雷菌中，檢出含CTX-M基因菌株91株，TEM基因25株，SHV基因19株，DHA基因48株，KPC基因10株，MOX基因3株， OXA基因1株，oprD2基因7株。

表2 287株粘質沙雷菌的藥敏結果(%)

3 討論

革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因有產β-內酰胺酶、外膜蛋白改變以及主動泵出機制等，而產β-內酰胺酶仍然是革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥最常見和最重要的原因，對粘質沙雷菌而言，最為常見的耐藥機制是由質粒介導的獲得性ESBLs的產生，其檢出率可高達80%[3],本組資料中，在287株粘質沙雷菌中ESBLs的檢出率為11.1%，明顯低于扈會整[3]80%的檢出率，存在差異的原因，可能是與不同醫院間抗菌藥物的應用種類以及菌種的選擇不同有關。ESBLs的耐藥基因型主要有CTX型、TEM型、SHV型等，在135株多重耐藥菌的粘質沙雷菌中，檢出含CTX-M基因菌株91株、TEM基因25株、SHV基因19株，說明本地區粘質沙雷菌ESBLs的耐藥基因型主要為CTX型，占主導地位，該耐藥基因的特點是對頭孢噻肟的水解活性遠高于頭孢他啶，這也很好的解釋了本組資料中，粘質沙雷菌對頭孢噻肟的耐藥率為64.8%，遠高于頭孢他啶的30.0%。

AmpC酶的過量產生是粘質沙雷菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的另一個常見原因。AmpC酶是由細菌染色體上ampC基因編碼，并受ampD、ampR、ampE和ampG調節基因所調控[6]。按其產生的方式分為3類：誘導高產酶、持續高產酶和持續低產酶。誘導高產酶的產生往往與β-內酰胺類抗菌藥物的存在有關，而持續高產酶則在有無β-內酰胺類抗菌藥物存在的條件下均可持續高水平產生。由于持續高產AmpC酶大多由質粒介導，因而可導致耐藥菌株的廣泛傳播。本研究AmpC酶的檢出率為15.3%，與周田美[7]的12.2%較一致，高于楊海飛[8]的7.7%，低于趙虎[9]的33.3%，說明AmpC酶的檢出在不同醫院間存在較大差異。

本研究結果顯示，同時產ESBLs和AmpC酶菌株16株，檢出率為5.6%，這一結果說明粘質沙雷菌既能通過質粒介導產ESBLs，又能通過染色體介導(或質粒介導)產生AmpC酶對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥。

革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的機制是產生碳青霉烯酶，以KPC酶為主，目前已發現的KPC型酶已有11種，分別從KPC-1型至KPC-11型[10]。本研究在19株耐亞胺培南的粘質沙雷菌中，有11株檢出KPC-2型酶，說明本地區粘質沙雷菌對亞胺培南耐藥的主要機制是產生KPC酶。另外，膜孔蛋白的改變也僅在亞胺培南耐藥的粘質沙雷菌中發現，提示，膜孔蛋白的改變可能是粘質沙雷菌對亞胺培南耐藥的另一個重要機制。

藥敏結果顯示，粘質沙雷菌對氨芐西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟、氨曲南、慶大霉素、環丙沙星以及哌拉西林等臨床常用抗菌藥物的耐藥率較高，耐藥率均大于60%，對亞胺培南、美羅培南、舒普深的耐藥率較低，耐藥率均小于10%。說明粘質沙雷菌多重耐藥現象較為嚴重，應引起臨床的高度重視。

綜上所述，本地區粘質沙雷菌對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥機制包括產生各種β-內酰胺酶、膜孔蛋白改變等，其中主要以產生各種β-內酰胺酶為主要耐藥機制，包括AmpC酶、ESBLs和碳青霉烯酶。本地區粘質沙雷菌β-內酰胺類耐藥基因型主要為CTX-M型和DHA基因型。產β-內酰胺酶菌株的基因型復雜多樣，并且存在較大的地區差異，因此，對臨床分離菌株進行連續監測，不僅能更好的體現出產β-內酰胺酶菌株耐藥基因的流行情況，而且對減少抗菌藥物的選擇壓力以及防止耐藥菌株的傳播流行等方面均具有十分重要的意義。

參考文獻：

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[3]扈會整，劉漢芳，劉 婧，等.黏質沙雷菌的產酶現狀及抗菌藥物耐藥性的研究[J].國外醫藥抗生素分冊，2011,32(2)：94.

[4]Clinical and Laboratory Standards Instiute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Twentieth informational supplement.CLSI/NCCLS document M100-S20[R].Pennsyivania:Clinical and Laboratory Standards Instiute.Clinical and Laboratory Standards Instiute,2010,20-143.

[5]隋秀麗，蘇維奇.陰溝腸桿菌產AmpC酶和ESBLs的檢測及其耐藥機制研究[J].中國實驗診斷學，2010，14(8):1255.

[6]Schmidtke A J,Hanson N D.Model system to evaluate the effect of ampD mutations On ampC-mediated beta-lactam resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(6):2030.

[7]周田美，董曉勤，俞云松，等.沙雷菌屬耐藥現狀及β-內酰胺酶檢測[J].中華醫院感染學雜志，2005,15(1)：103.

[8]楊海飛，程 君，胡立芬，等.黏質沙雷菌中AmpC酶的檢測及藥敏率分析[J].安徽醫學，2012,33(2)：129.

[9]趙 虎，涂 婉，蒙 杰，等.醫院感染中革蘭陰性桿菌AmpC β-內酰胺酶產酶率分析[J].檢驗醫學，2009,24(10):721.

[10]胡付品，朱德妹.KPC型碳青霉烯酶研究進展[J].中國感染與化療雜志，2011,11(1)：76.