青島地區(qū)大腸埃希菌臨床株中blaCTX-M和PMQR基因的檢測

尉鴻飛，牟曉東，朱元祺，馬金龍，趙靜宜*，劉新利

(1.齊魯工業(yè)大學 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南250353;2.中國石油大學(華東)化學工程學院 生物工程與技術中心，山東 青島266580;3.青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 青島266003)

大腸埃希菌是臨床腸桿菌科細菌中常見的機會致病菌，頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物是兩種臨床應用最廣泛的抗生素，過度使用導致了耐藥菌的逐漸增加。國內(nèi)傳播最廣泛的頭孢菌素耐藥基因是blaCTX-M，該基因常常位于可移動質(zhì)粒上，造成頭孢菌素耐藥性在不同細菌間水平傳播。細菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性包括染色體編碼的垂直耐藥性和質(zhì)粒介導的傳播耐藥性兩種機制。由于質(zhì)粒能夠加速耐藥基因在臨床病原菌中的傳播，因而，質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥性(plasmid mediated quinolone resistance，PMQR)在近十年中引起了全球關注。迄今PMQR已經(jīng)報導了三種機制：qnr基因編碼的靶酶保護機制，aac(6’)-Ib-cr基因編碼的藥物失活機制，qepA和oqxAB基因編碼的藥物外排機制。這三種機制已經(jīng)在世界范圍30多個國家的臨床和環(huán)境分離腸桿菌中檢測到[1]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，許多臨床分離的大腸埃希菌可對頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物同時耐藥，多種PMQR基因與bla基因組合在菌株中被檢測到[2]，這將促進臨床病原菌多重耐藥性的產(chǎn)生，進而加劇細菌感染控制和治療的難度。本研究旨在調(diào)查青島地區(qū)大腸埃希菌臨床分離株中blaCTX-M基因和PMQR基因的流行性，為醫(yī)院感染控制和臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

107株大腸埃希菌于2012年采自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院的門診和住院患者。采集樣品來自不同的臨床標本，包括血液、膽汁、胸腹水、導管、咽拭子、膿瘡或傷口等。細菌鑒定采用Vitek-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)，細菌耐藥性檢測判定標準參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI 2010)進行，以EscherichiacoliATCC25922 和KlebsiellapneumoniaeATCC700603作為質(zhì)控菌株。

1.2 主要培養(yǎng)基與生化試劑及儀器

離心柱型-基因組提取試劑盒和電泳級瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司)、PCR試劑盒和核酸分子量標準及限制性內(nèi)切酶FokI(大連寶生物工程有限公司)、Mueller-Hinton培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)、PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)、全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)、Vitek-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(法國Biomérieux公司)。

1.3 blaCTX-M基因和PMQR基因的檢測

使用離心柱型-基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，blaCTX-M基因和PMQR基因篩選引物參照文獻報道[3-5](見表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以細菌基因組DNA為模板，PCR檢測菌株帶有的blaCTX-M基因和各種PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA及oqxB基因)，選取代表性的PCR產(chǎn)物進行DNA序列測定。對于aac(6’)-Ib-cr基因，PCR技術[5]檢測菌株帶有的aac(6’)-Ib基因，陽性菌株的基因擴增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶FokI處理并進行DNA序列測定，鑒定cr變體。

表1 本研究使用的引物信息

2 結果

2.1 大腸埃希菌臨床分離株的藥敏試驗結果

107株大腸埃希菌均對氨芐西林耐藥，95%的菌株對頭孢噻肟、頭孢唑啉和頭孢曲松耐藥，88%和82%的菌株分別對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥。89株細菌同時對頭孢菌素類及氟喹諾酮類藥物耐藥。詳見表2。

表2 大腸埃希菌對臨床常用抗生素耐藥結果(n=107)

2.2 blaCTX-M基因和PMQR基因的檢測結果

在107株臨床分離大腸埃希菌中，90株菌帶有blaCTX-M基因，64株菌帶有一種或多種PMQR基因。其中，3株帶有qnrB基因，6株帶有qnrS基因，41株帶有aac(6’)-Ib-cr基因，5株帶有qepA基因，25株帶有oqxAB基因。qnrA、qnrC、qnrD基因未檢測到。值得注意的是，60株菌同時帶有blaCTX-M和PMQR基因，其中有10株同時帶有兩種PMQR基因，包括3株帶有aac(6’)-Ib-cr和qnrS基因，3株帶有aac(6’)-Ib-cr和qepA基因，兩株帶有aac(6’)-Ib-cr和qnrB基因，兩株帶有aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因；3株同時帶有三種PMQR基因，包括1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qnrB和oqxAB基因，1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qnrS和oqxAB基因，1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qepA和oqxAB基因。各種耐藥基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結果見圖1。

圖1 耐藥基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結果

M：100 bp DNA Ladder；0：陰性對照；1：blaCTX-M基因(551 bp)；2：qnrB基因(264 bp)；3：qnrS基因(428 bp)；4：aac(6’)-Ib-cr基因(482 bp)；5：qepA基因(218 bp)；6：oqxA基因(392 bp)；7：oqxB基因(512 bp)。

3 討論

在本研究中，我們對青島地區(qū)臨床分離的107株大腸埃希菌進行了頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物的耐藥性測定。結果表明，83%的菌株同時對頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物耐藥，說明分離的大腸埃希菌中存在多種耐藥基因。考慮到質(zhì)粒介導的耐藥基因更易引起細菌耐藥性傳播以及blaCTX-M和PMQR基因的廣泛流行，我們對細菌分離株進行了blaCTX-M基因和四類PMQR基因的檢測。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase，ESBL)是引起腸桿菌科細菌對頭孢類抗生素耐藥的主要機制，而頭孢噻肟高水解酶基因blaCTX-M是我國主要流行傳播的ESBLs基因[6]。王鳳平等[7]的調(diào)查顯示，在產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中，主要是CTX-M型。在本研究中，95%的菌株對頭孢噻肟耐藥，blaCTX-M基因在84%的菌株中被檢測到，是流行性很高的ESBL基因。

超過80%的菌株對環(huán)丙沙星或左氧氟沙星耐藥，并且60%的菌株帶有PMQR基因。其中aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因流行性最高。38%的菌株帶有aac(6’)-Ib-cr基因，遠高于浙江溫州[8]該基因的流行率(7%)。在臨床菌株中oqxAB基因相較其他PMQR基因報道較少，本研究中23%的菌株帶有oqxAB基因，遠高于上海[9]該基因的流行率(6.6%)。56%的菌株同時帶有blaCTX-M和PMQR基因，這將更有利于多重耐藥性的傳播，進而增加細菌性感染治療的難度。

綜上，本研究得到如下結論：首次證實blaCTX-M基因和PMQR基因在青島地區(qū)臨床分離大腸埃希菌中廣泛流行，且常共存于菌株中。這將加速該地區(qū)多重耐藥菌的產(chǎn)生并增加細菌性感染治療的難度。因而，增加對臨床多重耐藥菌及耐藥基因共存的檢測，通過合理使用抗生素，防止耐藥菌株的擴散，避免多重耐藥菌的產(chǎn)生及傳播非常緊迫。

作者簡介：尉鴻飛(1986-)，男，在讀碩士研究生，主要研究方向：微生物學與分子生物學。

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