深圳市婦女宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

關嵩青,林 莉,葉 菲

(深圳市第二人民醫院 婦科，廣東 深圳518035)

近年來眾多各國學者對宮頸癌的病因以及宮頸鱗狀上皮細胞發生癌變機制的分子流行病學研究資料表明，99.7%的宮頸癌的發生和發展過程與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)，特別是與高危型人乳頭瘤病毒(High-risk HPV,HR-HPV)的持續感染密切相關[1]，是宮頸癌的主要致癌因素。在目前所有已知的HR-HPV亞型中,感染率最高的是 HPV16型,約占58%。據文獻報道,與其他的HPV亞型相比,HPV16 型更容易在宮頸鱗狀上皮細胞內長期復制生存[2]，引起宮頸鱗狀上皮內瘤樣病變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)[3]的可能性更大，它是通過致癌基因E6的原癌蛋白與p53相互作用,形成新的蛋白復合物,使p53降解、功能減弱甚至喪失,破壞p53介導的細胞對DNA 損傷的免疫應答，導致細胞周期紊亂,不斷加重DNA 損傷,最終引起癌變[4]；另一方面通過致癌基因E7的原癌蛋白與視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)結合，激活細胞周期,引起組織細胞增殖[5]。由此可見，HR -HPV E6、E7基因都是早期致癌基因，它們二者在宮頸上皮細胞的表達在其癌變發生過程和維持惡變細胞惡性表型兩方面都起著極其重要的作用。

為了解深圳市宮頸癌患者癌組織中HPV16型E6、E7致癌基因的結構特點,本研究對我院1 例在深圳市居住了17年、HPV16型感染的宮頸癌患者的手術標本進行了HPV16型 E6、E7致癌基因克隆及一級結構分析，探討深圳市HPV16型地方株與德國標準株 E6、E7基因核苷酸序列的差異。

1 材料和方法

1.1 標本來源

來源于深圳市第二人民醫院宮頸癌手術切除組織標本,組織病理診斷為宮頸鱗狀細胞癌，按FIGO 分期為Ⅱb期,特異性PCR 分型確定為HPV16 型陽性。該患者40歲，至發病止在深圳居住生活17年。

1.2 HPV16型E6基因檢測

1.2.1 設計、合成PCR引物 設計HPV PCR L1基因引物和HPV16型E6基因引物是參考GenBank的德國標準株中的序列，自行設計，引物序列如下：MY09:5′-GCCTMCRAGRAGAWTCAGCT-3′；MY11:5′-CGCMGAGGCWTAAAAYTAGG-3′；HPV16 E6上游:5′-AGTAGCTGCGTAAGAAATGA-3′；HPV16 E6下游:5′-TTTGTTACGGTTCGGATAC-3′。

1.2.2 PCR 擴增HPV16型 E6基因及HPV L1基因 提取本例宮頸癌患者手術切除標本癌細胞中的DNA，作為樣板，在高保真Taq酶的作用下PCR擴增HPV L1基因，將PCR擴增所得產物2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳所測得的序列與Blast序列比對分型，挑選出HPV16型標本，再用HPV16型E6基因引物對其PCR擴增，挑選在500 bp附近處出現DNA帶的標本，最后予以純化。

1.2.3 檢測序列 把前述已提純的PCR產物在DNA自動序列分析儀(AB I3730型)上通過MY11、MY09引物的作用，用PCR直接測序法，對目標基因的正負雙鏈從正反雙方向同時測序，對突變標本則重新PCR擴增，反復測序，旨在防止PCR擴增過程產生的誤差，導致實驗數據不精確。應用同樣方法對HPV16 E6基因的目標基因正、負鏈從正、反雙方向予以測序。

1.2.4 HPV 16型 E6基因多態性分析 以Blast序列與前述測出的序列進行比對分型，應用DNAstar5.0和MEGA3.1軟件分析HPV16型E6基因的多態性。

1.3 HPV16型 E7 基因測定

1.3.1 質粒和宿主菌 在Promega公司購買pGEM-Teasy載體，采用揚州大學比較醫學中心提供宿主菌DH5α。

1.3.2 試劑 常規的分子生物學試劑如異丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、限制性內切酶、Taq聚合酶等上海生物工程公司購買，在大連寶生物公司購買DNA Marker和T4DNA連接系統，在QIAgen公司購買凝膠回收試劑盒和DNA提取試劑盒

1.3.3 癌組織DNA提取 嚴格按照DNA提取試劑盒上的說明書進行，采用標準的酚、氯仿方法提取宮頸癌標本組織中的DNA。

1.3.4 擴增HPV16型E7基因 (1)設計特異性引物：以GenBank收錄的德國標準株全序列DNA為樣板，做適當調整后，自行設計包含HPV16型E7基因完整閱讀框(562-858)在內的特異性引物：下游引物：5′-GGAAGCTTTTATGGTTTCTGAGAAC-3′；上游引物：5′-GCGAATTCATCATGCATGGAGATACACC-3′；同時在上游引物5′端設計了EcoRI酶切位點，在下游引物5′端設計了HandIII酶切位點。

(2)以宮頸癌組織標本癌細胞中提取的DNA作為模板，用PCR法在HPV16型的特異性引物的作用下進行型別鑒定，之后用E7基因的特異性引物PCR擴增HPV16型E7基因。擴增參數定為：94℃5 min，94℃40 s，57℃1 min，72℃1 min，四個步驟循環30次，最后一次循環72℃延伸6 min。

1.3.5 克隆HPV16型E7基因 對經PCR擴增所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳找到E7擴增帶，把相應的凝膠片段用凝膠回收試劑盒回收，將目標片段與載體pGEM-Teasy連接，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，經過藍白斑篩選，最后用HandIII、EcoRI雙切酶進行酶切鑒定。

1.3.6 測定HPV16型E7基因的序列 由上海生工生物工程公司對HPV16型E7基因的序列進行測定。運用DNAStar軟件分析所測得的E7基因序列。

2 結果

2.1 PCR擴增HPV16 型E6、E7基因的結果

以本例宮頸癌患者手術切除標本癌細胞中的DNA 為樣板,在高保真Taq酶的作用下，PCR法擴增HPV L1基因，將PCR擴增產物2%瓊脂糖凝膠電泳,在約500 bp 處清晰可見到一特異的條帶(圖1),與預計片斷大小一致。

2.2 HPV16型 E6、E7基因重組質粒的構建

將PCR 擴增所得產物回收后，連接線性克隆載體pGEM-Teasy,構建成了HPV16 E6E7 2p GEM-Teasy重組質粒。之后將前述的重組質粒經轉化，以及Hand Ⅲ和EcoRI雙酶切鑒定后，進行陽性克隆篩選。結果酶切電泳顯示預計的片段與重組質粒的插入片段大小一致(圖2)。

圖1 HPV16 E6E7基因的PCR擴增結果

圖2 HPV16 E6E7重組質粒

2.3 HPV16型 E6、E7 基因序列測定及分析

由上海生工生物工程技術服務有限公司將插入的重組質粒用T3、T7通用引物從正、反兩個方向測序,測序得深圳地方株HPV16型 E6、E7基因序列。用DNAStar軟件比較GenBank收錄的德國標準株HPV16型E6、E7基因序列和本研究中測序克隆所得的HPV16型 E6、E7 基因序列,結果表明德國標準株HPV16 型E6、E7基因序列與本研究中克隆的HPV16型 E6、E7 基因序列完全相同。

3 討論

多項研究資料表明高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)是一種嗜組織鱗狀上皮細胞DNA的無包膜病毒,其基因組約長8 kb,呈雙鏈高度螺旋化的環狀結構,包含3個功能區：長控制區(long control region,LCR)、早期基因區( E 區)和晚期基因區(L 區)。其中早期轉錄區基因組長約4 500 bp,包含6個開放讀碼結構(ORF),它們分別編碼E1 、E2-E7 6 個早期蛋白,共同參與病毒DNA的轉錄、復制、細胞轉化、翻譯和調控等過程。其中HPV16型 E6 基因組全長包含477 個核苷酸,從83 位到559 位,分別對151 個氨基酸殘基的病毒原癌蛋白進行編碼。E6基因與p53的相互作用是E6 基因的致癌關鍵，它可引起p53 降解、功能減弱甚至喪失,使其減弱或喪失對細胞增殖周期中多個相關因子，如Cyclins、p21、Cdks、PCNA 等因子的調節作用,不斷加重了細胞中DNA 受損，最終導致細胞癌變[4]。E7基因組全長包含297個核苷酸,從562 位到858 位,分別對98 個氨基酸殘基的病毒原癌蛋白進行編碼,該基因組是病毒的主要轉化基因,它編碼了病毒的E7 蛋白，后者是含有“Cys2X2X2Cys”鋅指結構的細胞DNA結合蛋白。E7 蛋白的C 端有2 個鋅指結構,N 端有37個氨基酸，是E7蛋白的活性轉化區,其結構與SV40 T和腺病毒E1 A 抗原的結構類似,能與抑癌基因蛋白Rb、P53等相結合,干擾后者的抑癌功能,可導致機體細胞惡性轉化、永生化以及使細胞維持惡性的表型[6]。Song等[7]認為,在 HR -HPV致癌過程中,在癌產生的早期E7基因主要導致細胞轉形,在癌產生的后期E6基因主要引起細胞惡化。

眾多研究人員在不同地區和國家從不同角度對當地HPV16型E6、E7基因分析的過程中，發現不同地區HPV16型E6、E7基因之間存在一些細小差異。目前研究結果顯示,HPV16 型不同類型的變異株具有不同的致癌潛能和生物學活性[8]。有研究認為,病毒的致癌能力的強弱一方面與病毒的變異和類型相關,另一方面也與宿主的HLA 多態性相關。因此病毒變異株的致癌能力可能會因為地區不同而發生某些變化[9]。Yamada Matsumoto等[9]報道在日本宮頸癌患者中野生型E6 基因(德國株)分布的頻率大概為34%,然而Zehbe 等[8]報道在瑞士宮頸癌患者中該基因分布頻率僅約為6%,與印度宮頸癌患者人群中該基因的分布頻率是基本相同的[10]。參考世界各地文獻,T350G是最有特征性的E6 基因突變，但在不同的地區此變異的分布頻率不同,為3.8%-78%。在我國，高慧等[11]設計了一對跨越HPV16型 E7基因全長的引物，進行序列測定后，與網上公布的非洲株、東亞株、德國標準株、香港株、亞美株等HPV16型 E7基因序列予以比較，發現在核苷酸水平上揚州地方株與德國標準株99.7%是一致的，僅在E7基因的ORF199位上的T變成了C，即核苷酸三聯密碼TTG變成CTG，但其所編碼的氨基酸結構與德國標準株一致，尤其是N端蛋白活性轉化區的37個氨基酸以及C端的60個氨基酸完全相同，說明了德國標準株(野生型)與揚州地方株的HPV16型E7基因序列是大致相同的。學者們根據各地文獻所報道不同地區HPV16型 E7基因序列，制作了該基因序列的系統發育進化圖，該圖清晰顯示東亞株、香港株、德國標準株與揚州地方株距離接近，可視為是一個系列，而非洲株和亞美株則相互接近，可視為是另一個系列，提示HR-HPV16型 E6、E7基因的突變具有明顯的地域性差異。伍欣星[12]等研究發現湖北地區HPV16型E7基因了出現新的變異株，經序列測定顯示有兩個堿基出現了C→T突變，直接導致這兩個堿基所編碼的氨基酸序列的C端蛋白多肽因基因的突變提前終止，但N端則是完整的。

本組資料從深圳地區1例宮頸癌患者臨床手術標本組織中成功擴增出HPV16型 E6、E7 基因,克隆到pGEM-Teasy載體中,再經酶切鑒定、測序后發現所克隆的HPV16型 E6、E7 全基因序列與Genebank 德國株序列完全一致,為日后進一步研究HPV 16 型E6、E7 基因及其蛋白表達提供了資料,為與HPV16型相關的宮頸癌治療性疫苗及診斷試劑的研發及宮頸癌防治等工作提供了信息。

作者簡介：關嵩青(1968-)，女，副主任醫師，主要從事婦產科臨床宮頸病變篩查及治療工作。

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