血紅素氧合酶-1介導金櫻子在阿霉素心肌損傷大鼠中的保護作用

羅衛民，劉越峰，羅湘玉，張 軍*

(1.湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院 心胸外科，湖北 十堰442000；2.湖北醫藥學院附屬十堰市人民醫院)

阿霉素(Doxorubicin，DOX) 是一種廣泛應用于腫瘤治療的蒽環類抗生素，是臨床上最有效的抗腫瘤藥物之一。盡管其對包括白血病在內的多種惡性腫瘤具有抑制作用，但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。DOX導致的毒性心肌病原因很多，其中活性氧(ROS)、鈣超載以及線粒體損傷介導的心肌細胞凋亡是其重要機制[2]。近年來，某些藥用植物在DOX所致的心肌細胞損傷中發揮重要作用[4]，如上調血紅素氧合酶(Heme oxygenase-1，HO-1)的表達，從而發揮抗氧化、抗凋亡等作用。金櫻子為薔薇科金櫻子(Rosa Laevigata Michx，RLM)的果實，研究發現它具有強大的抗氧化和清除自由基能力[5,6]。本課題組的前期研究結果顯示，RLM對DOX誘發的心臟毒性具有一定的保護作用，但其機制尚未明了。本研究旨在觀察HO-1在RLM心肌保護作用中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

DOX購自意大利Pharmacia公司(批號為8NB002-A)，血清LDH和CK-MB試劑盒為Stanbio產品。心肌caspase-3的比色測定試劑盒購自Quantikine。HO-1和Nrf2多克隆抗體購自Santa Cruz。金櫻子購于十堰市中草藥材公司，經去籽后用煎藥機進行熬煎，提取液濃度為2.0 g/ml。SnPP和其他分析純試劑主要購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗分組

成年雄性Wistar大鼠由湖北醫藥學院實驗動物部提供，體重(250±5)g，在SPF環境下給予標準實驗室的水和食物飼養2周。大鼠隨機分成4組(每組15只)，如下：組1：對照組(15只)，大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對照；組2： DOX組：大鼠連續兩周每間隔48h注射DOX(2.5 mg/kg,i.p.) 共6次，使其累積劑量達15 mg/kg。組3：DOX 治療組：在組2的基礎上，大鼠每日給予RLM(5 g/kg)灌胃，DOX停止后，持續RLM灌胃4周。組4：SnPP干預組：在組3基礎上，給予20 μmol/kg SnPP腹腔注射，每周3次，持續時間同組3。

1.3 血清CK和LDH活性的測定

采用分光光度計在波長340 nm處測量CK-MB的吸光度。LDH的測量按照南京建成生物工程研究所產品提供的診斷試劑盒進行，計算血清總LDH的活性(U/L)。

1.4 心肌HO-1活性測定

將獲取的心肌組織勻漿18 000×g 4℃離心10 min，獲取400 μl上清加到反應混合物中(含0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸鹽、0.2U葡糖糖-6-磷酸鹽-1脫氫酶、2 mg大鼠肝臟胞漿、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血紅素)。反應在黑暗的環境中37℃孵育1h后加入1 ml氯仿終止反應。并在463 nm和530 nm雙波長測吸光度值(膽紅素吸光系數為40)，以生成的膽紅素量表示HO-1活性，單位為nmol/(mg protein.h)，并計算其與對照組的相對值。

1.5 caspase-3活性測定

50 mg心肌組織加入0.8 ml pH7.4的裂解緩沖液中制成勻漿。10 000 g 4℃離心15 min。獲取上清用于caspase-3測定。采用間接法測定caspase-3活性，基于caspase-3切除底物分子DEVD-pNA中的發光基團pNA，隨后在405nm處測量其吸光度，從而間接反應其活性。

1.6 Western blot檢測HO-1表達以及Nrf2核轉位

根據試劑盒(Pierce)提供的步驟提取心肌組織中的總蛋白和核蛋白，并測定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉印至PVDF膜上(Millipore)，并利用含有質量分數為50 g·L-1脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入抗HO-1(1∶500)、β-actin(1∶5 000)、抗Nrf2(1∶1 000)，抗TBP(1∶1 000)的抗體4℃孵育過夜。多次洗滌之后，加入HRP標記的二抗(1∶10 000 稀釋)孵育膜1 h。ECL法(Amersham)發光、顯影。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 RLM對血清CK-MB和LDH水平的影響

與正常組相比，DOX可導致血清LDH和CK-MB增高(P<0.01)，與DOX處理組相比， RLM可導致血清LDH和CK-MB水平顯著降低(表1)，而SnPP處理組中LDH和CK-MB水平明顯高于RLM組(P<0.05)，但與DOX組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 RLM對血清CK-MB和LDH水平的影響

aP<0.05 VS 對照組；bP<0.05 VS DOX 組；cP>0.05 VS DOX組

2.2 RLM對心肌HO-1活性的影響

DOX處理后，與對照組大鼠相比，心肌組織中HO-1酶活性輕微增高。而經5 g/kg RLM處理后，HO-1酶活性顯著增高。而同時用SnPP處理后，HO-1酶活性明顯低于RLM組，但仍高于對照組，見圖1。

1.陰性對照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP *P<0.05 VS 對照組；#P<0.01 VS DOX 組；△P>0.05 VS DOX組

2.3 RLM抑制caspase-3活性

DOX處理后，心肌組織中caspase-3活性增加了55%。同時經5 g/kg RLM處理后，caspase-3活性有所降低，而SnPP處理能再次上調caspase-3的活性，見圖2。

1.陰性對照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP *P<0.05 VS 對照組；#P<0.01 VS DOX 組；△P>0.05 VS DOX組

2.4 RLM對心肌組織中HO-1表達的影響

與對照組相比，DOX大鼠心肌組織中HO-1蛋白表達水平有輕微增高，而經RLM處理后，HO-1表達進一步增強(圖3)。SnPP處理能再次降低HO-1的表達。而內參β-actin含量保持一致。

1.陰性對照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP

2.5 RLM對轉錄因子Nrf2活化的影響

Western blot結果顯示，DOX大鼠心肌組織內細胞核中Nrf2含量與對照組相比增高不明顯，而RLM處理后，Nrf2轉位水平顯著增多，表明RLM能促進Nrf2從細胞漿轉移至細胞核中(圖4)。

1.陰性對照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP

3 討論

DOX是一種作用于DNA的蒽環類抗生素，它能夠對DNA發生嵌入作用，在臨床中應用廣泛。阿霉素的急性副作用包括惡心、嘔吐和心律不整。長期使用后，在線粒體氧化磷酸化作用下，阿霉素和鐵相互作用產生大量活性氧，可以破壞心肌，造成肌原纖維損傷或凋亡。HO-1是催化血紅素降解為CO、亞鐵離子和膽紅素的限速酶，并在機體的抗炎癥、抗氧化損傷中發揮重要作用[4]，本研究顯示，DOX毒性大鼠經RLM處理后，可顯著上調HO-1的酶活性以及其蛋白表達。HO-1基因的啟動子區域含有轉錄因子Nrf2的結合位點，本研究也證實RLM能誘導Nrf2從細胞漿轉位至細胞核，從而激活Nrf2誘導HO-1表達。

Nrf2是機體一種重要的獲得性保護性核轉錄因子。在非激活情況下，Nrf2通過與抑制物keap1結合于細胞質內。當細胞受到外源性刺激時，Nrf2從keap1中分離出來，轉移至細胞核內，從而與應激誘導性基因包括HO-1的啟動子區域的抗氧化劑應答元件結合[5]。本研究發現RLM處理后，Nrf2轉位增加，這與心肌組織中HO-1蛋白表達以及酶活性的趨勢一致，表明RLM誘導HO-1的表達可能是由于Nrf2的活化所致。HO-1的代謝產物如CO和膽綠素在多種肺部疾病包括ALI中發揮抗氧化和抗炎癥作用，包括抑制促炎癥細胞因子、趨化因子、ROS形成[6]。為了進一步評價HO-1在RLM的保護效應中的作用，在干預過程中加入SnPP，對RLM的保護作用進行了分析。結果表明，DOX模型大鼠血清LDH和CK-MB顯著增高，而經RLM處理后，這些心肌損傷指標顯著降低。同時給予SnPP處理后，能顯著逆轉RLM的保護效應。這表明RLM是通過上調HO-1蛋白的表達并上調其酶活性，從而發揮對心肌細胞的保護作用。

DOX致心肌細胞損傷的機制很多，包括離子和自由基假說、代謝機制和凋亡機制。心肌細胞是終末分化細胞，多種抗腫瘤藥物可引起其壞死或凋亡，從而引起心肌細胞減少而導致心臟收縮功能不足。研究顯示，DOX可通過內源性和外源性機制引起心肌細胞凋亡，最終激活下游caspase-3，6和7。一旦caspase被激活，細胞即進入凋亡執行階段。本研究發現，RLM可抑制DOX引發的caspase-3激活，而HO-1抑制劑SnPP處理后，caspase-3活性再次增高，這表明HO-1能在一定程度上削弱DOX的促凋亡效應，最終抑制DOX引起的心肌細胞凋亡、壞死及心肌纖維化。

綜上所述，本研究認為RLM可以促進Nrf2核轉位，從而誘導心肌組織內HO-1表達上調，增強其酶活性，進而通過HO-1對DOX導致的心肌細胞凋亡產生抑制作用。

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