兔脂肪間充質干細胞向胰島素樣分泌細胞分化及鑒定

郭 偉,孫 昱，楊海山

(吉林大學白求恩醫學部中日聯誼醫院 放射線科,吉林 長春130033)

脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)最早由Zuk[1]等人于2001年從抽脂術中抽取的脂肪組織中分離培養，近年來已成為醫學領域乃至整個生命科學領域的研究熱點。ADSCs是一種來源于脂肪組織中的多能干細胞，和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 類似，也有很強的增殖能力和分化潛能。ADSCs能在不同的誘導微環境下向不同的組織細胞(如脂肪細胞、成骨細胞、內皮細胞、心肌細胞和神經細胞等) 分化[1]。本實驗在體外分離培養兔的脂肪間充質干細胞，通過相應的試劑使其誘導分化為類胰島素分泌細胞，并研究其生物學特性，以期為臨床采用ADSCs治療Ⅰ型糖尿病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級新西蘭大白兔3只，2.0-2.5 kg，雄性，購自吉林大學實驗動物中心，實驗過程中對實驗動物的處置符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2 ADSCs的分離培養

將新西蘭大白兔以2 ml/kg標準，用濃度為1.5%的戊巴比妥經耳緣靜脈注射麻醉，無菌條件下獲取其腹股溝部位的脂肪組織，然后仔細清除脂肪外包被的筋膜及血管，用含雙抗的PBS反復沖洗多次，并將其剪碎成糊狀，再加入適量的0.15%Ⅰ型膠原酶，于37℃水浴恒溫搖床消化30-50 min。然后將其用100目篩網過濾，濾液以1 200 r/min離心5 min，棄去上層的脂肪滴及上清，將底部的沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養液重新懸浮，然后接種于培養瓶中。24小時后首次更換培養液，以后每三天更換一次。當貼壁細胞長滿瓶底壁面積的70%-80%后用0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶2或1∶3比例傳代。

1.3 繪制細胞生長曲線

采用MTT法繪制ADSCs生長曲線：分別取第3、5、10代的ADSCs，以1×104/mL的密度分別接種于96孔培養板內，每孔200 μl；每天同一時間，每組各取3孔細胞，每孔加入5%四唑鹽(MTT)20 μl，孵育4小時后棄去孔內液體；用培養液洗兩次后分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，輕微震蕩20 min后用酶標儀測定波長490 nm處各孔的吸光度(OD)。以3個平行樣品的平均值為縱坐標，以時間 (d) 為橫坐標，來繪制細胞生長曲線。

1.4 ADSCs向胰島素分泌細胞誘導分化并進行雙硫腙染色鑒定

取第三代脂肪間充質干細胞，以1×105/mL的密度接種于6孔板中，先用原有的無血清培養液于37℃，5%CO2條件下孵育12 h后，撤去上述培養液，然后根據實驗目的將培養的細胞分為對照組和誘導組分別培養。其中對照組只用單純的高糖DMEM進行培養，誘導組將分三個階段逐步進行誘導分化：(1)加入含有1 mmol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖DMEM，培養2天；(2)加入含有10 μg/L 堿性成纖維生長因子、2% B27、10 μg/L 表皮生長因子、2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖DMEM，培養6天；(3)加入含20 mmol/L 尼克酰胺、100 nmol/L胰高血糖素樣肽-1(glucagons-like peptide-1，GLP-1)、1 mmol/L 2-巰基乙醇的高糖DMEM，培養6天，并于相差顯微鏡下觀察各階段細胞的形態變化。然后分別取對照組和誘導組14 d的細胞爬片，再用0.1 mg/ml的雙硫腙溶液(將50 mg雙硫腙加入5 ml DMSO溶解作為儲備液，使用時取0.1 ml加入10 ml PBS中，將其抽濾后作為染色液)進行染色，于37℃下孵育15 min后，于倒置顯微鏡下觀察兩組細胞的著色情況。

1.5 葡萄糖刺激胰島素釋放試驗

取第三代脂肪間充質干細胞，以2×105/mL的密度接種于24孔板中，每孔細胞數量為1×105個，將其分為空白對照組、低糖刺激組和高糖刺激組。對照組為未誘導的脂肪間充質干細胞。低糖刺激組和高糖刺激組以上述方法進行誘導，并于誘導后第7天、14天和21天時，每組各取8個培養孔，分別加入低糖DMEM(10.0 mmol/L)和高糖DMEM(30.0 mmol/L)培養液0.5 ml，繼續培養24 h后，收集24孔板中的上清液，用Insulin-ELISA試劑盒檢測其胰島素含量。同時檢測對照組的細胞培養液，將其作為陰性對照。

1.6 ADSCs表面抗原標志檢測

取第三代脂肪間充質干細胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化10 min，PBS沖洗3遍，離心后的沉淀用500 μL Binding Buffer緩沖液懸浮，然后分別與5 μL CD29-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC，CD80-FITC室溫下避光孵育30 min，再用流式細胞儀檢測CD29，CD44，CD45，CD80的表達。

1.7 統計學方法

用SPSS 14.0軟件對數據進行統計，組間比較采用Student’st檢驗方法進行統計學分析。結果以Mean±S.D.表示，P<0.05表示結果具有顯著性差異。

2 結果

2.1 ADSCs的細胞形態

原代培養的兔ADSCs12小時開始逐漸貼壁，24小時完成貼壁， 其形態多呈短梭形或多角形。瓶內懸浮的球形或圓形的未貼壁細胞多為未除盡的血細胞，其在第一次更換培養液時即可除去。隨著培養時間延長，貼壁的細胞數量逐漸增多，形態變為長梭形，呈團簇狀生長，逐漸形成細胞集落(圖1)。第一代傳代細胞約2-4小時開始貼壁，12小時后開始快速增殖，約3天即可長滿培養瓶底壁(圖2)。實驗觀察結果顯示，兔的ADSCs可連續傳多代而保持原有的細胞形態和活力，適合作為組織工程的種子細胞。

圖1 原代培養的兔ADSCs(×200倍)

圖2 傳代培養的兔ADSCs(×200倍)

2.2 ADSCs的生長曲線分析

結果顯示，多代ADSCs的生長曲線形態相似(圖3)，都于第3天進入對數生長期，第6天時達到峰值，約從第7天開始進入平臺期，呈典型的“S”形細胞成長曲線。說明兔ADSCs具有相對穩定的遺傳特性。

圖3 ADSCs的生長曲線

2.3 ADSCs向胰島素分泌細胞的分化

顯微鏡下觀察顯示，在誘導分化過程中的第一階段ADSCs細胞形態無明顯變化；第二階段細胞形態變橢圓，且折光度增強；到第三階段時細胞周邊突觸逐漸縮短，中心漸變圓，14天時可見半懸浮的胰島樣細胞團。誘導14天時的雙硫腙染色結果顯示：對照組細胞不著色；誘導組的細胞染色后呈棕紅色(圖4)，證明該細胞團中有胰島素成分。

2.4 葡萄糖刺激胰島素釋放試驗結果

圖4 14天時ADSCs的雙硫腙染色結果

兔ADSCs誘導后第7天時低糖刺激組和高糖刺激組胰島素表達均為陰性；第14天培養液中可以檢測到胰島素分泌，低糖刺激組胰島素分泌量為13.2±2.1 μIU/ml，高糖刺激組其值為14.1±1.7 μIU/ml，兩組之間無顯著性差異(t=1.622，P>0.05)；第21天時兩組胰島素濃度較第14天時均增高，其中低糖刺激組為17.1±2.2 μIU/ml，高糖刺激組為20.7±1.8 μIU/ml，兩組之間有顯著性差異(t=6.847，P<0.05)。空白對照組均未檢測出胰島素。

2.5 ADSCs表面標志檢測結果

結果(圖5)可見，CD29和CD44表達陽性，陽性率分別為99.98%和98.88%，而CD45和CD80表達陰性，檢出率分別為1.32%和2.32%。

圖5 ADSCs的表面標志的流式檢測結果

3 討論

本實驗選用了以尼克酰胺和GLP-1為主要試劑的誘導方案，將ADSCs誘導分化為胰島素樣分泌細胞。其中尼克酰胺是一種ADP-核糖合成酶抑制劑，能促進內分泌細胞的分化，其主要是通過它的代謝產物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)起作用。有研究表明尼克酰胺還可以促進干細胞的分化，促進胰島素分泌細胞的生成[2,3]。此外，尼克酰胺還能增加胚胎干細胞(ESCs)分化成胰島素分泌細胞的數量[4]。GLP-1是小腸L細胞分泌的一種腸降血糖素。它能刺激胰腺β細胞的分化和增殖，抑制β細胞凋亡[5]，增加胰島β細胞的數量，從而促進胰島素的分泌。體外研究表明，GLP-1還可以誘導骨髓干細胞[6]、nestin陽性的胰島源性干細胞[7]，使其分化為胰島素分泌細胞并分泌胰島素。

雙硫腙可與多種重金屬離子(鋅、鎘、鉛等)形成螯合物，是測定重金屬離子濃度的高靈敏試劑。胰島細胞由于含有鋅離子，能與雙硫腙螯合形成紫紅色的絡合物，呈陽性反應，因此可以用雙硫腙染色來鑒定胰島細胞[8]。在本實驗中，經過誘導14天后的ADSCs，培養瓶內的細胞團能夠被雙硫腙特異染色，說明該經過誘導14天后的ADSCs有細胞分化為胰島細胞。而且葡萄糖刺激胰島素釋放試驗陽性，說明ADSCs誘導分化的胰島素樣細胞可以分泌胰島素，并且隨著葡萄糖濃度的增加，其分泌量也明顯增加，證明ADSCs誘導后的胰島素樣細胞對糖刺激敏感，其胰島素的分泌受到外部環境中糖濃度的影響。實驗表明，誘導后的ADSCs具有類似體內胰島細胞的功能，并通過血糖變化調節胰島素分泌。

本實驗探討了CD29、CD44、CD45、CD80等相關表面抗原分子在ADSCs上的表達及其意義。CD29作為整合素家族之一，能介導細胞與細胞外基質黏附，參與免疫細胞黏附，為T細胞活化提供協同刺激信號；CD44是基質細胞表面抗原；CD45是造血干細胞表面標志[9]；CD80，即B7-1，是一種重要的共刺激分子，表達在活化B細胞及其他APC表面，是T細胞表面CD28分子和細胞毒性T細胞相關抗原-4(CTLA-4)的配體，具有協同刺激分子的作用。本實驗中，用流式細胞儀檢測ADSCs表面的抗原標志物的表達，結果顯示CD29、CD44高表達，CD45、CD80表達呈陰性，與文獻報道相一致[10,11]。ADSCs高表達CD44，而不表達CD45說明ADSCs來自于基質細胞，而非血液循環中的造血干細胞，這也與其組織來源相吻合。

與干細胞的其他來源組織相比較，脂肪間充質干細胞易于體外培養，且可抑制免疫排斥反應，是一種適合的組織工程種子細胞。本實驗證明脂肪間充質干細胞還能誘導分化為類胰島素分泌細胞，發揮胰島素降血糖的作用，這為今后脂肪間充質干細胞用于Ⅰ型糖尿病的治療提供了理論依據。

作者簡介：郭偉(1981-)，男，在讀醫學博士，主要從事脂肪間充質干細胞向胰島素分泌細胞的分化研究。

參考文獻：

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