CCL20在人體炎癥牙髓表達的免疫組化研究

張志鷹,張志民,閆勝男，翟利云

(吉林大學口腔醫院 牙體牙髓病科，長春130021)

牙髓炎是人體常見的口腔疾病，是由于細菌(主要為G-菌)入侵牙本質包繞的牙髓而引起的一種炎癥反應[1]。趨化因子是一類指導白細胞移行到炎癥感染部位，由多種細胞產生，可誘導的一類低分子量的(多為8-10 kD)分泌蛋白，在炎癥反應中具有重要作用[2]。CCL20，CC亞族趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20)，依據2000年公布的新的命名法則命名[3]，曾稱巨噬細胞炎癥蛋白-3α，由1997年被Rossi等首次利用生物學技術鑒定發現。CCL20是趨化因子CC家族中的重要一員，由多種細胞產生，CCL20是一類對多種細胞如未成熟DC、單核細胞或T淋巴細胞具有明顯趨化作用的細胞因子，對人體的免疫反應和炎癥反應都有密切的關系，其唯一的受體是趨化因子受體6(chemokine receptor6,CCR6)[4,5]。在炎癥疾病中，CCL20的主要功能是趨化未成熟的效應T細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞等，對球菌和G-桿菌有較強的抗菌活性，是一種天然的抗菌蛋白。目前，已有學者研究了CCL20及其受體CCR6的表達變化在乳腺癌、宮頸病變、牛皮癬發病機制中的作用[6-8]，以及其在支氣管哮喘發病中的作用機制[9]。牙髓疾病一般是由細菌侵襲牙髓牙本質復合體，引起牙髓組織發生炎癥反應，與體內其它部位相似，目前，并無CCL20與牙髓炎癥疾病相關的報道，其在牙髓疾病中的發生、發展的作用機理也尚不清楚。本實驗采用免疫組織化學檢測法，檢測人體正常、慢性及急性炎癥中CCL20在牙髓組織中的表達，初步揭示CCL20是否參與牙髓炎癥的應答反應，為進一步探討CCL20在牙髓損傷修復中的具體調控作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗標本與主要試劑

實驗所用標本來源由吉林大學口腔醫學院2013年2月-10月接受口腔牙體牙髓科及口腔正畸科治療的患者自愿提供。急性牙髓炎組(AP)，慢性牙髓炎組(CP)，正常牙髓組(NS)各20例(正畸科取無齲壞，無牙周病，無牙髓炎癥的正常牙)，患者年齡16-65歲之間。所用標本全部選用無關節炎病史及全身系統性疾病史，并且為兩個月內未服用免疫抑制劑及抗菌藥物，之前未做過牙髓治療的標本。1抗：Rabbit Anti-CCl20 antibody(bs-1268R) ；2抗：SP Kit(Broad Spectrum) (SP-0022)；DAB顯色劑；PBS；檸檬酸修復液；抗體稀釋液

1.2 實驗方法

1.2.1 牙髓組織切片 取臨床上慢性，急性牙髓炎及正畸患者的牙髓組織，拔出后立即置入40 g/L多聚甲醛中，4℃恒溫固定24 h后，根據不同的牙髓組織癥狀，分為3組(急性炎癥組，慢性炎癥組，正常對照組),每組20例，再次恒溫4℃固定，固定時間為24 h，牙髓組織常規脫水后石蠟包埋，做成5 μm厚度的切片。將3組標本共60例逐個進行HE染色后免疫組化染色并在光學顯微鏡下觀察。使用HE染色結果來當作病理學分組標準進而區分個組標本。

1.2.2 免疫組化染色 石蠟切片常規脫水至水化，PBS沖洗5 min,3次，高溫修復抗原(沸水浴修復15 min，自然涼至室溫，PBS沖洗5 min,3次，正常山羊血清封閉，37℃20 min，一抗孵育(比例1∶100)，4℃過夜，滴加生物素標記的第二抗體(羊抗兔IgG)37℃20 min，辣根酶標記的鏈酶親和素(三抗)，37℃20 min,DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明后中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察人炎癥牙髓組織中CCL20的表達

1.2.3 結果判定 陽性細胞的判定特征：細胞膜、細胞質呈現黃色，可見棕黃色染色顆粒。陽性細胞率計算方法：在400倍光學顯微鏡下，從每個標本隨機選取4個視野，查取各個視野下CCL20陽性細胞數，同時查取整個視野細胞總數，按照公式：陽性細胞%=陽性細胞數/細胞總數×100%計算各個視野下陽性細胞比例，求4個視野下陽性細胞比例的平均值，即為陽性細胞率。

1.2.4 統計學分析 使用統計軟件SPSS19.0做方差分析，通過Q檢驗比較每兩組間CCL20陽性細胞率的差異性，當P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡下所見

2.1.1 健康牙髓組 鏡下可見大量的組織細胞、成纖維細胞，散在T細胞、樹突狀細胞，未見B細胞。其中T細胞主要分布在牙髓邊緣區域。T細胞和樹突狀細胞的細胞膜、細胞質未見黃染，無棕黃色顆粒，即CCL20無表達(如圖1)。

2.1.2 炎癥牙髓組 不用牙髓標本及同一切片的不同區域陽性細胞密度明顯不同。鏡下可見慢性牙髓炎組黃染程度明顯強于急性牙髓炎組(如圖2、3)。

鏡下可見炎癥牙髓中有大量T細胞、B細胞浸潤，樹突狀細胞增加并聚集。炎癥細胞主要分布于病變區域，其中急性組中T細胞浸潤少于慢性組，兩組之間B細胞浸潤無明顯差異。在炎癥細胞浸潤區域可見B細胞、T細胞、樹突狀細胞的細胞膜、細胞質呈不同程度的黃染，其中細胞質染色較淺同時可見棕黃色顆粒(如圖4、5、6)。

圖1健康牙髓組，×200圖2炎癥牙髓組(慢性)，×200圖3炎癥牙髓組(急性)，×200

圖4CCL20在炎癥牙髓樹突狀細胞中的表達，×200圖5CCL20在炎癥牙髓T細胞中的表達，×200圖6CCL20在炎癥牙髓B細胞中的表達，×200

2.2 統計學分析

CCL20的陽性細胞率統計分析如表1所示， 3組標本CCL20的陽性細胞表達率有顯著性差異(P<0.05)。

表1 各組牙髓標本中CCL20陽性細胞表達率(%)

3 討論

CCL20屬趨化因子CC亞族，相對分子質量為9000[10]，基因定位于2q35-36，包括4個外顯子和3個內含子[11-13]。CCL20可在不同因素刺激下由多種細胞分泌產生，包括成纖維細胞、樹突狀細胞、記憶T細胞，及某些腫瘤細胞[14]。CCR6為CCL20的唯一受體，可與CCL20特異性結合，主要表達于記憶T細胞、未成熟樹突狀細胞、B細胞以及淋巴細胞。CCL20的生物學特性復雜，主要包括以下幾個方面：①CCL20與其受體CCR6相互作用控制B細胞的分化、發育。趨化未成熟樹突狀細胞向炎癥部位遷移，活化單核巨噬細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞；②增強T淋巴細胞、單核細胞遷移能力，促進其與內皮細胞的黏附；③趨化B細胞，并刺激活化B細胞產生多種免疫球蛋白等。

牙髓組織炎癥是由宿主對病原體發生的免疫反應造成的，包括非特異性炎癥反應和特異性免疫反應。當牙髓組織即便是牙本質小管中，受到病原體如變形鏈球菌、革蘭陰性厭氧菌、普沃雷菌等入侵時都會發生炎性變化。炎性變化的組織部位有大量的巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及漿細胞存在，炎性變化部位的局部還存在一些免疫球蛋白，主要為IgG。牙髓組織發生炎癥反應時，既有多種免疫球蛋白如IgG、IgA、IgE、IgM等存在，又有淋巴細胞、多種T細胞及其介質參與的免疫反應存在，所以體液免疫和細胞免疫在牙髓組織炎癥過程中均發揮著重要的作用。

本實驗采用免疫細胞化學技術首次檢測人體炎癥牙髓組織中CCL20的表達。結果顯示，CCL20主要在牙髓組織細胞的細胞漿內表達，細胞膜、細胞核多不表達。并且在人體炎癥牙髓組織中CCL20 表達較高，而正常牙髓組織CCL20基本不表達，當牙髓組織受到細菌、致炎因子、細菌分泌的代謝產物等侵襲時，CCL20的表達明顯增加，說明CCL20參與了牙髓炎癥反應，當人體牙髓組織自身的防御能力過弱或者病原體的刺激過強時，在病原體的不斷刺激下，中性粒細胞、單核巨噬細胞、活化T細胞等細胞會分泌多種炎癥細胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，也會增加CCL20在組織中的表達，而趨化因子CCL20的上調表達又會活化并趨化樹突狀細胞、中性粒細胞、T細胞等細胞向病損部位遷移，并刺激B細胞產生多種免疫球蛋白如IgG、IgA、IgE等,在此防御過程中，不可避免地會造成組織的損傷與破壞。由此推測趨化因子CCL20在牙髓組織炎癥狀態下可能具有致炎作用，CCL20通過上調表達調動了機體的炎癥免疫應答水平。

綜上可以確定，牙髓組織炎癥反應與CCL20的表達存在一定的相關性，由于趨化因子CCL20以及其受體CCR6作用網絡及在炎癥時牙髓組織免疫反應機制的復雜性，CCL20在牙髓組織免疫應答時具體的調控作用以及與其他牙髓組織中的趨化因子、制炎因子的相關聯系還有待深入的研究。

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