常見JAK2基因突變的篩檢及在BCR-ABL陰性骨髓增殖病中的臨床意義

徐修才，伍 權，鄭 南，丁凱陽，劉 欣

(安徽醫科大學附屬省立醫院 1.中心實驗室；2.血液科，安徽 合肥230001)

以腫瘤基因學為基礎的骨髓增值性疾病(MPD)鑒別診斷，主要是通過檢測BCR-ABL融合基因及JAK2基因突變完成,BCR-ABL陽性者被診斷為慢性髓細胞白血病(CML),陰性者考慮CML以外的MPD，后者常見的為真性紅細胞增多癥(PV),原發性血小板增多癥(ET)以及原發性骨髓纖維化(IMF)。目前，國內外大多采用等位基因特異性聚合酶鏈反應技術(AS-PCR)檢測V617F突變，但是MPD患者中還可出現其他突變，特別是PV患者。JAK2 V617F以外的突變主要發生于第12外顯子，因此對MPD患者同時進行JAK2 V617F和JAK2 exon12突變檢測是非常需要的。本研究建立一種多重位點特異性PCR篩選方法并探討其在骨髓增殖性疾病中的臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1研究對象所有病例來自2011年12月至2012年11月間在我院住院和門診隨訪的BCR-ABL 陰性的MPD患者149例為研究組，其中男78 例，女71例，年齡21-86歲，平均(54.5±10.1)歲，包括PV 73例，ET 51例，IMF 25例。對照組35 例，其中急性白血病20 例，男11例，女9例，年齡19-78歲，平均(53.0±11.5)歲;健康對照15例，男8 例，女7例，年齡21-62 歲，平均(33.2±8.5)歲。所有患者均經過我院常規骨髓細胞形態學、組織化學、免疫表型、融合基因、染色體、骨髓病理檢查等確診，符合相應疾病的2008年WHO診斷標準。

1.2方法

1.2.1 基因組DNA提取 取200 μl患者骨髓或外周血及健康志愿者外周血標本，應用Karroten 血液基因組DNA 提取試劑盒(快速型)提取DNA，具體操作步驟按照說明書進行。所有DNA樣品經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測以確定質量良好后，-20℃保存備用。

1.2.2 多重位點特異性PCR檢測 PCR引物分別根據5種突變型基因序列設計(見表1)。PCR反應使用的Taq酶和10×PCR buffer等購買自MBI公司。PCR反應體系總體積25μl，包括1×PCR buffer、MgCl21.5 mmol/L、dNTP 200μmol/L、8條引物各200 μmol/L、Taq酶1.5U、基因組DNA 50 ng。PCR反應在Biometra Tgradient型PCR儀上進行。PCR反應條件：95℃預變性8 min,循環中95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，共循環40次；循環后72℃延伸10 min。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據電泳條帶大小判斷標本中有無JAK2基因突變和突變類型。JAK2突變陽性的標本，分別選擇4例，送上海生物工程公司進行測序驗證。

1.3統計學方法所有數據用SPSS 13.0統計軟件分析處理。正態分布的計量資料采行t檢驗，計數資料應用χ2檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1凝膠電泳分析多重AS-PCR擴增產物149例MPD患者中共檢出118例患者存在JAK2突變，其中PV患者陽性68例，ET患者陽性35例，IMF患者陽性15例(見表2，圖1)。20例白血病患者和15例健康對照者中均未檢出JAK2基因突變。

2.2基因測序驗證突變陽性結果

將所有JAK2 exon12突變陽性和3例JAK2 V617F突變陽性的MPD患者標本送測序。測序結果顯示，第254堿基處JAK2 V617F突變陽性樣本為G/T重疊峰(雜合突變，圖2A);4例通過本方法檢測為K539L突變的標本經基因測序分析，1例為H538Q合并K539L復合突變(圖2B)，另3例檢測為K539L突變(圖2C)。

表1 多重AS-PCR 篩選JAK2突變所用引物序列

M:DNA 分子量Marker;1:空白對照;2:陰性標本;3,4:K539L突變5:V617F突變;6:陰性對照

圖1多重位點特異性PCR擴增JAK2基因突變電泳圖

2.3外周血細胞的分析

我們對于149例病例(包括PV、ET、IMF 3組)的外周血計數進行了分析。發現突變型的白細胞計數以及血紅蛋白計數較野生型高，均差異有統計學意義(均P<0．05)。而對于血小板計數，突變型也較野生型高，但是差異無統計學意義，見表3。

圖2 JAK2突變測序圖

病種總例數野生型例數突變性例數突變率PV7356893.2%ET51163568.6%IMF25101560%合計1493111879.2%

表3 JAK2突變與血液學特征之間的關系

**P≤0.0005；*P≤0.0001 compared with the wild type of the same MPD

3 討論

2005年Baxter等多個研究組[1，2]報道了MPD患者存在高致病性的獲得性基因突變：JAK2V617F突變，在JAK2基因的第1849位密碼子由G變成T后，JAK2激酶的第617處纈氨酸(V)被苯丙氨酸(F)取代(JAK2V617F)。后續的研究又發現在部分JAK2V617F陰性的MPD患者中可檢測到JAK2 exon12突變或其他突變，尤其在多數JAK2V617F陰性的PV患者中可檢測到JAK2 exon12突變。JAK2基因突變的發現改變了MPD的分類和診斷標準，WHO 2008年修訂的MPD診斷標準中已把JAK2V617F突變列為首選檢測項目，對JAK2V617F突變陰性但仍疑診PV的患者應考慮有無JAK2基因其他突變的可能[3]。JAK2V617F以外的突變主要發生于exon12，因此運用在臨床上簡便易行的方法對MPD患者進行JAK2V617F和JAK2exon12突變檢測是必要的[4]。

由于使用的檢測方法不同，JAK2V617F突變在PV、ET和IMF中陽性率分別達65%～97%、23%～57%和35%～57%[5-7]。在JAK2V617F陰性的MPD患者中5%～40%可檢測到JAK2exon12突變，主要出現于PV患者中[8]。本實驗中，PV中陽性率為93.2%；ET中陽性率為68.6%；IMF中陽性率為60%；和國內外運用AS-PCR檢測JAK2V617F的文獻報道的突變率相比，陽性率有所提高[9，10]。149例MPD患者中檢測出4例 exon12突變，均經過測序證實，其中3例為PV患者，1例ET患者。在本項研究中，JAK2突變陽性的3種MPD患者白細胞計數，PV患者的血小板計數及ET患者的血紅蛋白，突變型較其野生型高，差異均有統計學意義。這些結果和最近國內外的研究報道基本一致[11，12]。我們在ET患者中也檢測出exon12突變，這表明V617F以外的突變也可能發生在除PV以外的MPD患者中。由于發現的陽性病例較少，JAK2 exon12突變陽性患者的臨床和血象特征與JAK2V617突變陽性者是否有差異仍有待積累病例進一步研究。

我們采用外周血單個核細胞提取基因組DNA為檢測樣本，通過多重PCR，對149例MPD臨床標本具有較高的陽性檢出率；而對15例健康正常人和20例急性白血病患者進行檢測，均沒有發現陽性結果。研究結果表明BCR/ABL陰性的MPD中JAK2的陽性率與其他血液惡性疾病有顯著性差異，JAK2可以作為篩查BCR/ABL陰性的MPD的一項重要指標。多重等位基因特異性PCR具有很好的特異性和準確性，能有效提高突變檢出率，簡單易行，具有較好的臨床應用價值。

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