臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦梗死大鼠行為學(xué)及膽堿能的影響

賈芙蓉，張貫石，王 輝，潘洪濤，何 欣，張 東，丁冬梅

(1.解放軍第二〇八醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130062；2.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；3.解放軍第65316部隊(duì)醫(yī)院；4.解放軍第65571部隊(duì) 衛(wèi)生隊(duì))

腦梗死導(dǎo)致的腦部血液供應(yīng)障礙、缺血、缺氧可引起腦組織壞死，會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙，導(dǎo)致行為學(xué)的改變。全部的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)都屬于膽堿能神經(jīng)。乙酰膽堿(Ach)是乙酰膽堿能神經(jīng)元系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，與膽堿能系統(tǒng)功能的損害程度密切相關(guān)[1]。Ach由乙酰膽堿酯酶(TChE)分解，通過Ach受體發(fā)揮生物效應(yīng)。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的樹突或胞體含有大量TChE，能夠?qū)ChE分泌到細(xì)胞外液中。TChE直接參與植物神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、肌肉運(yùn)動(dòng)、大腦思維、記憶等重要功能。TChE活力有改變時(shí)，以上各組織器官功能也會(huì)改變。TChE參與細(xì)胞的發(fā)育和成熟，能促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生。通過測(cè)定TChE和Ach的活性可反映腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的功能。

我們?cè)隗w外成功培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)的基礎(chǔ)上[2]，將UC-MSCs經(jīng)尾靜脈注入腦梗死大鼠體內(nèi)，觀察大鼠行為學(xué)、腦2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染色及膽堿能的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

2，3，5—氯化三苯基四氮唑(TTC)，美國Sigma公司。乙酰膽堿酯酶(TChE)試劑盒，南京建成生物化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2010727。乙酰膽堿(Ach)試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20120808。考馬斯亮藍(lán)蛋白，南京建成生物化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20100520。CO2恒溫培養(yǎng)箱，上海申工。 YJ-1450超凈工作臺(tái)，蘇州潔諾公司。101-1-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)。4℃冰箱，星星公司。DL-5000冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾公司。R450型酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司。天池魚線，日本橫濱產(chǎn)，直徑0.28 mm，栓線的頭端用酒精燈火焰燒，使之成球形。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，2-3月齡，體重250-350 g，購于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)用鼠均飼養(yǎng)于解放軍第二〇八醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心級(jí)潔凈空調(diào)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。在(22±2)℃，濕度為(50±5)%的環(huán)境下標(biāo)準(zhǔn)鼠食喂養(yǎng)，飲用水為自來水。12 h光照，12 h黑暗。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及模型復(fù)制

1.3.1 SD大鼠54只，隨機(jī)分為3組，即臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)移植組(以下簡(jiǎn)稱UC-MSCs組)、模型組、假手術(shù)組，每組18只大鼠。

1.3.2 UC-MSCs組及模型組的復(fù)制模型參照Longa等[3]方法，并改進(jìn)陳佳俊等[4]的方法，栓塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈。假手術(shù)組：僅分離頸總及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎大腦中動(dòng)脈，不插入魚線。

1.4 MCAO模型大鼠標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)

于大鼠造模清醒后30 min，根據(jù)Persson[5]的方法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：正常；Ⅰ級(jí)：對(duì)側(cè)前肢屈曲；Ⅱ級(jí)：提尾時(shí)，對(duì)側(cè)前肢抓力減弱；Ⅲ級(jí)：自主運(yùn)動(dòng)無方向性，提尾時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；Ⅳ級(jí)：自主運(yùn)動(dòng)時(shí)，向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)。選擇Ⅲ級(jí)及以上模型大鼠進(jìn)行治療。各組大鼠在移植后第10天進(jìn)行行為功能檢查。

1.5 方法

1.5.1 UC-MSCs的原代培養(yǎng)、傳代、收集細(xì)胞 按照本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[2]。

1.5.2 細(xì)胞移植 MCAO模型建立后24 h，將UC-MSCs組制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)大鼠尾靜脈UC-MSCs組緩慢注入含有細(xì)胞1×106/ml生理鹽水溶液1 ml，腦梗死組注入生理鹽水1 ml。

1.5.3 移植后腦梗死模型大鼠的行為學(xué)與運(yùn)動(dòng)功能觀察 各組大鼠于造模后24 h、尾靜脈注射后第10天以平衡木實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。采用平橫木行走實(shí)驗(yàn)(Beam walking Test，BWT)[6]，即大鼠于200 cm×10 cm×1 cm橫木。距地面高40 cm，以10°角度向下爬行，在造模前訓(xùn)練3 d，連續(xù)3次評(píng)分達(dá)9分方進(jìn)入本試驗(yàn)。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：在30 s內(nèi)爬過橫木，左側(cè)后肢少于2次內(nèi)滑倒計(jì)9分；在30-90 s內(nèi)爬過橫木，左側(cè)后肢少于2次滑倒計(jì)8分；在90s內(nèi)爬過橫木，長于50%距離正確用左側(cè)后肢爬行計(jì)7分；短于50%距離正確用左側(cè)后肢爬行計(jì)6分；左側(cè)后肢能置于橫木上，向前爬行時(shí)均下滑計(jì)5分；在90 s內(nèi)爬過橫木，左側(cè)后肢不能置于橫木上計(jì)4分；90 s內(nèi)爬過30%橫木計(jì)3分；90 s內(nèi)爬過30%橫木，不能在橫木上停留90 s計(jì)2分；爬過短于30%橫木，能在橫木上停留90 s計(jì)1分；爬過短于30%橫木，不能在橫木上停留90 s計(jì)0分。

1.5.4 TTC染色觀察腦組織變化 分別在移植術(shù)后第20天每組隨機(jī)抽取一只處死，全部動(dòng)物均按規(guī)定斷頭，腦組織取出后即置于-20℃低溫冰箱快速冷凍后，從前腦額級(jí)開始行冠狀切片，由前向后間隔切取組織片5片，每片約2 mm，置2%TTC生理鹽水中37℃孵育30分鐘，待顯色完全，取出中間腦片在自然光線下數(shù)碼相機(jī)照相。

1.5.5 TChE活力的測(cè)定和Ach含量的測(cè)定 尾靜脈注射UC-MSCs第10天，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，每組每次取9只大鼠腹主動(dòng)脈采血并斷頭取其治療前、后腦組織。血液經(jīng)肝素抗凝(每亳升血液含20單位肝素)，離心分離血漿。斷頭處死大鼠，在冰臺(tái)上取出大鼠海馬，快速分離雙側(cè)海馬結(jié)構(gòu)制備勻漿，TChE試劑盒、Ach試劑盒分別測(cè)定腦組織和血漿中乙酰膽堿含量和乙酰膽堿酯酶活性，蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)，術(shù)后動(dòng)物行為表現(xiàn)

大鼠造模清醒后30 min，模型組大鼠頭偏向患側(cè)，患側(cè)眼裂變窄，患側(cè)肢體無力，提尾時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)。假手術(shù)組未見行為異常。移植第10天，除假手術(shù)組外，各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分逐漸增高，第10天MSC組與模型組的評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。三組比較結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.01；與模型組相比，▲P<0．05

2.2 TTC染色

TTC染色大鼠正常腦組織染色呈紅色，梗死區(qū)呈白色。用AutoCAD軟件計(jì)算和測(cè)定腦組織梗死面積和總腦片面積，以腦梗死面積占總腦片面積百分?jǐn)?shù)(%)表示，見圖1、圖2。梗死面積比較采用t檢驗(yàn)，治療后20天UC-MSCs組與造模后24 h模型組相比，P<0.01，結(jié)果見表2。

注：箭頭所指位置為腦梗死區(qū)域

2.3 TChE和Ach測(cè)定

UC-MSCs移植對(duì)腦梗死大鼠海馬區(qū)和血漿中TChE和Ach均有影響。結(jié)果見表3，UC-MSCs組與模型組相比，海馬TChE活性明顯增高，P<0.05；UC-MSCs組與模型組相比，海馬Ach活性明顯增高，P<0．05。

圖2 UC-MSCs治療20天后腦梗死大鼠腦組織TTC染色，×200

組別腦梗死面積模型組24 h25.30±7.6UC-MSCs組治療20天0.55±0.36*

注：與模型組24 h腦梗死面積相比，*P<0.01

分組乙酰膽堿酯酶(TChE)乙酰膽堿(Ach)假手術(shù)組1.42±0.15 20.58±1.81模型組1.00±0.17*16.67±1.75*UC-MSCs組1.38±0.20▲ 20.06±1.78▲

注：與假手術(shù)組相比，*P<0．05；與模型組相比，▲P<0．05

表4表明，UC-MSCs組與模型組相比，血漿TChE活性明顯增高，P<0．05；UC-MSCs組與假手術(shù)組相比，P>0．05 ；UC-MSCs組與模型組相比，血漿Ach活性明顯增高，P<0．05。

分組乙酰膽堿酯酶(TChE) 乙酰膽堿(Ach)假手術(shù)組6.74±0.52 11.31±1.31模型組5.62±0.56* 8.02±1.35*UC-MSCs組7.03±0.69▲ 12.06±1.65▲

注：與假手術(shù)組相比，*P<0．05；與模型組相比，▲P<0．05

3 討論

外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)組織有一定的再生能力，這些神經(jīng)纖維或細(xì)胞體內(nèi)部都含有高水平的TChE。神經(jīng)損傷早期TChE在神經(jīng)元胞體和近端軸突內(nèi)的活性增強(qiáng)。TChE可能參與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，還具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)神經(jīng)組織的發(fā)育和神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子樣作用。

神經(jīng)細(xì)胞死亡導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺陷，至今尚無有效的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪、胎盤、臍帶血以及臍帶中分離出來，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞比來源于骨髓、胎盤及其他組織的MSCs更具有優(yōu)勢(shì)，如臍帶的來源不受倫理爭(zhēng)議，成本較低；UC-MSCs具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)、基質(zhì)支持、旁分泌、遷移和基因穩(wěn)定性，故具有良好的臨床治療潛能。目前，已有多種方法成功地將UC-MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，還可分化為特定類型的神經(jīng)元細(xì)胞[7-10]。這種潛能，使其具有作為種子細(xì)胞應(yīng)用于修復(fù)或替代受傷和病變的神經(jīng)組織，從而為腦梗死等一些神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病的治療提供了一個(gè)新的途徑。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死大鼠海馬、血漿內(nèi)TChE和Ach活性下降，提示存在膽堿能系統(tǒng)異常。UC-MSCs經(jīng)靜脈移植后20天，可改善腦梗死大鼠行為功能，增強(qiáng)海馬TChE和Ach活性，說明UC-MSCs移植能明顯改善膽堿能系統(tǒng)的功能和行為能力，達(dá)到治療腦梗死的目的，這可能與其提高膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的活性和UC-MSCs在腦內(nèi)存活并分化為新生的神經(jīng)元有關(guān)。有報(bào)道，bFGF治療血管性癡呆大鼠，癡呆組大鼠海馬TChE活性較假手術(shù)組明顯升高，治療組大鼠海馬TChE活性較癡呆組降低[11]。大鼠血管性癡呆與腦梗死模型同樣引起神經(jīng)元受損，但TChE變化不同，相關(guān)機(jī)理待進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)能夠分泌多種白細(xì)胞介素、巨噬細(xì)胞克隆刺激因子、Flt-3配體及干細(xì)胞因子等[12]，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)鼠類海馬神經(jīng)前體細(xì)胞的生存、生長及分化[13]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示BMSCs還可增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌[14]。這些營養(yǎng)因子促使宿主內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞向成熟神經(jīng)元分化，其中包括膽堿能神經(jīng)元，從而使Ach水平增加， TChE活性上調(diào)。因此，BMSCs移植改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能的原因可能與這些因子的分泌有關(guān)，UC-MSCs移植是否有相同作用，其有關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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