微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的變化對(duì)海馬梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響研究

金翊思,袁 波

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，黑龍江 大慶163000；2.大慶市油田總院 肺科與職業(yè)病科二病房，黑龍江 大慶163000)

腦缺血導(dǎo)致患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙，其功能的恢復(fù)可通過(guò)再學(xué)習(xí)而獲得，但由于患者多同時(shí)存在記憶功能的障礙，嚴(yán)重影響患者提高自身的軀體運(yùn)動(dòng)功能，更影響其生活質(zhì)量。目前，針刺、康復(fù)訓(xùn)練治療缺血后記憶能力障礙的效果較好，但相關(guān)作用機(jī)制還不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)以針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練作為干預(yù)手段，探討針灸結(jié)合康復(fù)的方法對(duì)海馬梗死大鼠的MAP-2表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并試探性闡述其作用機(jī)制[1，2]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

所選試驗(yàn)動(dòng)物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)scxk(京)2009-0001]，均為健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，共50只，體重200g-250 g。將大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、針刺組、康復(fù)組和針刺結(jié)合康復(fù)組(簡(jiǎn)稱“針康組”)，每組10只大鼠。采用光化學(xué)法誘導(dǎo)海馬缺血模型。各組于術(shù)后24 h進(jìn)行干預(yù)。

1.2 主要儀器、試劑

選購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的虎紅粉劑；由哈爾濱工業(yè)大學(xué)提供的冷光源；選購(gòu)于華北正華生物儀器設(shè)備有限公司的Morris水迷宮；選購(gòu)于淮安市天劍工具廠的Y-型迷宮；購(gòu)自美國(guó)Stant公司的MAP-2一抗試劑盒，產(chǎn)品(批號(hào)2005070)；購(gòu)自北京中山試劑公司的二抗試劑盒，產(chǎn)品(批號(hào)2005012)。

1.3 制備模型

光化學(xué)法誘導(dǎo)法：用10%水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射將大鼠麻醉，于俯臥位將大鼠放置在腦立體定位儀上，沿頭部正中將大鼠頭皮切開(kāi)，暴露顱骨到前囟點(diǎn)，在前囟點(diǎn)后3.5 mm、中線向左旁開(kāi)2.0 mm處，用牙科鉆鉆開(kāi)一個(gè)直徑為1 mm的骨窗，將光纖管尾端探至硬膜下3.3 mm處。用生理鹽水稀釋虎紅，濃度為1.5%，按70 mg/kg 于腹腔注射，注射時(shí)間為2 min。5 min后照射局部海馬組織。照射時(shí)間5 min。手術(shù)結(jié)束后縫合頭皮，正常喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅進(jìn)行常規(guī)麻醉(沿頭顱切開(kāi)頭皮，用牙科鉆在前囟后3.5 mm、中線向左旁開(kāi)2.0 mm處鉆孔，然后縫合頭皮)。

1.4 干預(yù)方法

針刺組：大鼠術(shù)后24 h參照于致順頭部腧穴七區(qū)劃分法和《大鼠穴位針灸圖譜》，選擇0.25 mm×15 mm針具取頂區(qū)進(jìn)行針刺，進(jìn)針深度3-10 mm，留針6 h。康復(fù)組：大鼠術(shù)后24 h進(jìn)入Morris水迷宮接受訓(xùn)練，從平臺(tái)所在象限外的其他3個(gè)象限，隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期。將大鼠面向池壁放入池中，如果大鼠2 min內(nèi)找不到平臺(tái)，就將大鼠放到平臺(tái)上停留30 s，后將其放回籠中。此種情況潛伏期記為120 s。訓(xùn)練時(shí)依次從3個(gè)不同的入水點(diǎn)入水，每次大鼠的入水點(diǎn)相同，訓(xùn)練的順序固定。每日訓(xùn)練1次。主要訓(xùn)練大鼠的游泳和學(xué)習(xí)記憶功能能力。針康組：大鼠術(shù)后24 h后每日針刺留針6 h，Morris水迷宮訓(xùn)練1次。模型組：術(shù)后自然恢復(fù)，不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 標(biāo)本采集 干預(yù)14 d后，于大鼠檢測(cè)行為能力后灌注取材。按大鼠0.35 ml/100 g體重的劑量，腹腔注射10%水合氯醛0.5 ml，將大鼠深度麻醉，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，將灌注針刺入心尖，沿左心室將管插至主動(dòng)脈，固定插管，剪開(kāi)右心耳，先灌注0.9%的生理鹽水，見(jiàn)右心耳流出澄清液體，再灌注200 ml，濃度為4%多聚甲醛固定液。完成灌注后將大鼠斷頭取腦，所取組織放于4%福爾馬林溶液中固定24 h。24 h后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(從視交叉水平開(kāi)始進(jìn)行冠狀切片，厚度為5 μm)，采用免疫組織化學(xué)(S-P)法染色。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè) 將包埋的腦組織切片，石蠟切片先經(jīng)二甲苯脫蠟，再梯度酒精脫水；取過(guò)氧化氫去離子水孵育，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；枸櫞酸微波修復(fù)。滴加一抗(1∶50)，4℃下冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，2 min×3次；滴加二抗，37℃下孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加DAB顯色劑；后用蒸餾水進(jìn)行充分沖洗，蘇木素復(fù)染，用鹽酸乙醇分色、藍(lán)化；后梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，將制成切片置于放大鏡下(放大倍數(shù)為10×40)隨機(jī)選5個(gè)視野，顯色者為陽(yáng)性，對(duì)每個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 評(píng)估學(xué)習(xí)記憶能力

采用Y-型迷宮：Y-型迷宮是一個(gè)三等臂式迷宮，每臂頂端設(shè)有信號(hào)燈，將安全臂信號(hào)燈點(diǎn)亮，危險(xiǎn)臂不點(diǎn)亮信號(hào)燈。訓(xùn)練中每次無(wú)規(guī)則選取一安全臂。大鼠在通電后從所在臂跑到亮臂記為正確，如跑到暗臂記為錯(cuò)誤。每天分段訓(xùn)練大鼠，每段10次，兩段間隔2 min。如連續(xù)10次測(cè)試中有9次正確表明大鼠已掌握迷宮結(jié)構(gòu)，記錄大鼠掌握迷宮結(jié)構(gòu)所需的訓(xùn)練次,表明學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)的大鼠訓(xùn)練次數(shù)越少。以此可判斷大鼠學(xué)習(xí)分辨能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)估

Y-迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠的分辨學(xué)習(xí)能力明顯下降(與假手術(shù)組比較)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，干預(yù)組學(xué)習(xí)能力均有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且針康組療效最佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較次)

2.2 免疫組化檢測(cè)海馬MAP-2的表達(dá)

梗死灶周圍MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。各組大鼠的MAP-2表達(dá)較假手術(shù)組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各干預(yù)組表達(dá)更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，針康組最佳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠MAP-2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果個(gè))

3 討論

頭針作為一種整體性治療配合康復(fù)治療，使患者的大腦皮層在單位治療時(shí)間內(nèi)獲得更大的刺激量，激發(fā)大腦皮層相對(duì)無(wú)效的或新形成的通路，使原先未承擔(dān)此功能的結(jié)構(gòu)去承擔(dān)新的、不熟悉的任務(wù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦的重塑。臨床實(shí)踐中我們也發(fā)現(xiàn)，針灸結(jié)合康復(fù)之路可同時(shí)提高患者的肢體運(yùn)動(dòng)能力及認(rèn)知能力，兩方面功能的提高均優(yōu)于單純的針灸或康復(fù)訓(xùn)練，尤其是頭針治療(其中以前額部腧穴為主)療效最為突出?？梢?jiàn)，針康法將改善患者肢體運(yùn)動(dòng)功能及學(xué)習(xí)功能，這正符合現(xiàn)代偏癱康復(fù)中的提高運(yùn)動(dòng)整合水平的理念[3]。目前，針灸配合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的治療方法在臨床已取得良好療效，被稱作“新趨勢(shì)針灸”(NTA)[4]。本實(shí)驗(yàn)采取術(shù)后24 h干預(yù)14天，是因?yàn)橛醒芯勘砻?，腦缺血后神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)發(fā)生可能在1周以后，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)其生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用[5]。

MAP-2是一種熱穩(wěn)定的磷蛋白，哺乳動(dòng)物腦中含量豐富，是神經(jīng)細(xì)胞的骨架成分，主要在神經(jīng)元胞體、樹突和樹突棘表達(dá)，能調(diào)節(jié)微管蛋白組裝,是動(dòng)力學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，常被用來(lái)作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白[6-9]。根據(jù)Briones等[10]研究發(fā)現(xiàn)，短暫性腦缺血后的大鼠的表達(dá)增加，并同時(shí)表現(xiàn)出大鼠在水迷宮行為學(xué)參數(shù)的變化，提示MAP-2可能發(fā)揮了提高神經(jīng)功能的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后大鼠的分辨學(xué)習(xí)的能力明顯下降。針刺、康復(fù)訓(xùn)練以及針刺結(jié)合康復(fù)均能促進(jìn)學(xué)習(xí)能力的恢復(fù)，但針康法療效最佳。免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，各組大鼠的MAP-2表達(dá)均較對(duì)照組明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，受干預(yù)組表達(dá)更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且針康組效果最明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明單純康復(fù)訓(xùn)練、單純針刺與針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練均能明顯促進(jìn)神經(jīng)元樹突發(fā)芽和再生，進(jìn)一步促進(jìn)新的突觸形成，而后者作用更明顯。本實(shí)驗(yàn)中MAP-2蛋白表達(dá)增加的同時(shí)有腦梗死大鼠行為學(xué)的改善，并且與學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)呈正相關(guān)。表明針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練可明顯促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能，改善學(xué)習(xí)記憶能力。進(jìn)而促進(jìn)其軀體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的效率，提高生活質(zhì)量。在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們爭(zhēng)取能夠?qū)δX卒中患者的其他功能康復(fù)做更為廣泛的深入研究。

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