卡托普利對壓力負荷增加大鼠血清TNF-α表達的影響

趙智明 張靜 董曉蕾 趙凌杰 蔡輝

·論著·

卡托普利對壓力負荷增加大鼠血清TNF-α表達的影響

趙智明 張靜 董曉蕾 趙凌杰 蔡輝

目的觀察卡托普利對壓力負荷增加大鼠血清TNF-α表達水平的影響。方法采用腹主動脈縮窄術制備壓力負荷心肌纖維化模型，隨機分成3組：假手術組、模型組和卡托普利組。術后4周成功造模并開始給藥，療程4周。8周后觀察3組心臟質量指數和左心室質量指數、HE染色法觀察左心室心肌病理學、Masson染色法觀察左心室心肌膠原形態，圖像分析測量膠原容積分數(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)，ELISA法測定大鼠血清TNF-α的含量。結果與假手術組比較，模型組大鼠心臟質量指數和左心室質量指數均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組則均顯著降低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組大鼠CVF和PVCA均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組則均顯著降低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組則顯著降低(P<0.01)。結論卡托普利具有逆轉心肌纖維化的作用。

卡托普利；壓力負荷；腫瘤壞死因子-α；大鼠

高血壓心肌纖維化心力衰竭是一個漸進過程，控制心肌纖維化和心室重構在高血壓性心臟病發展過程中成為關鍵。TNF-α是一種具有多種生物學效應的細胞因子，可通過誘導心肌細胞肥大、細胞凋亡和調節細胞外基質合成等多種途徑參與心室重構發生和發展[1]。本研究以壓力負荷增加誘導心肌纖維化模型，觀察血管緊張素轉化酶抑制劑卡托普利對血清TNF-α的影響，并探討其意義。

1.1 實驗動物 清潔級6周齡Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，體質量160～200 g[許可證號：SYXK(蘇)2003-0032]，我院動物實驗中心提供。動物飼養室溫(23±3)℃，周期光照8∶00～20∶00，飼料、墊料高壓滅菌，常規飼料喂養，自由進食、飲水。

1.2 藥品與試劑 卡托普利片，12.5 mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司；TNF-α測定試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司(批號：KGERC102a)。

1.3 實驗方法

1.3.1 心肌纖維化模型制備及分組:采用Anversa等[2]方法用腹主動脈縮窄術制備壓力負荷增加心肌纖維化模型。大鼠適應性喂養5 d后，術前禁食12 h，自由飲水，手術組用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常規備皮消毒后，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在腎動脈上方分離腹主動脈，在腎動脈上方0.5 cm用內徑0.70 mm銀夾夾閉，使腹主動脈縮窄60%～70%，確認無出血，將臟器復位后逐層關閉腹腔，術后給予青霉素10萬U/kg肌內注射抗感染3 d，6 h后恢復飲食。造模成功標準：大鼠心臟質量指數(HWI)和左心室質量指數(LVWI)均明顯升高。假手術組不結扎腹主動脈，余處理同上。取術后存活大鼠24只，隨機分為3組，每組8只，分別為假手術組、模型組和卡托普利組。

1.3.2 給藥及分組:卡托普利組給予卡托普利100 mg·kg-1·d-1灌胃，3組每天上午給藥1次，連續給藥4周。假手術組及模型組均給予0.9%氯化鈉溶液1.5 ml·kg-1·d-1灌胃，連續4周。觀察3組大鼠的飲食、毛色、活動、水腫等一般性狀，每周稱體重(BW)。

1.3.3 HWI及LVWI測定:術后8周末，禁食12 h，將3組大鼠稱重后采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，取血完畢后，迅速開胸摘取心臟，于4℃ 0.9%氯化鈉溶液中洗去血液，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，稱取心臟質量(HW)，再剪去左右心房、右心室游離壁保留左心室及室間隔，稱取左心室質量(LVW)。分別計算HWI(HWI=HW/BW)和LVWI(LVWI=LVW/BW)，以HWI和LVWI作為判斷心肌肥厚的指標。透壁剪取左心室心尖部分組織投入液氮中留待檢測其他指標，其余標本放于4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.4 形態學檢測:心肌標本于甲醛中固定24 h后，常規取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長軸線每隔1 mm橫斷面切取數張4 μm厚的切片，作HE染色觀察心肌組織形態學改變。Masson染色觀察心肌間質和血管周圍膠原沉積情況，Masson染色下心肌細胞呈紅色，膠原呈藍色。應用Image-pro Plus Version 6.0軟件進行測量心肌膠原容積分數(CVF)和心肌血管周圍膠原面積和管腔面積之比(PVCA)。其中CVF=心肌膠原面積/所測視野面積，PVCA=小動脈管腔周圍膠原面積/管腔面積，每張心肌切片標本隨機取4個視野測量，取其平均值。

1.3.5 血清TNF-α濃度的測定:采取靜脈血，常規離心分離血清，存放于-20℃冰箱，ELISA法測定TNF-α，嚴格按試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態 術后第1周模型組和卡托普利組動物均精神萎靡，活動量減少，毛色暗淡，攝食及飲水減少，1周后好轉。整個實驗期間，假手術組大鼠一般狀況良好，對外界刺激反應靈敏，行動敏捷，毛色光澤，攝食及飲水正常，與術前未見明顯差別；模型組大鼠后期精神萎靡，行動遲緩，倦臥，毛色逐漸失去光澤；而卡托普利組大鼠的一般狀況較模型組明顯好轉。

2.2 HWI和LVWI測定結果 與假手術組比較，模型組的HWI和LVWI均顯著增大(P< 0.01)；與模型組比較，卡托普利組的HWI和LVWI顯著下降(P< 0.01)。見表1。

2.3 心肌組織病理學結果 光鏡下觀察可見：假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋明顯，胞核結構清晰，無細胞腫脹，心肌間質及微血管結果正常；模型組大鼠心肌纖維明顯增粗，排列紊亂、部分心肌細胞水腫、淺染，橫紋模糊，偶見心肌斷裂，肌束間隙呈不同程度增大，胞核固縮，部分出現局灶性、片狀壞死，間質可見炎性細胞浸潤；卡托普利組有顯著改善。Masson染色結果顯示：膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。可見，與假手術組比較，模型組心肌間質和血管周圍膠原沉積明顯增加，而卡托普利組膠原沉積顯著減輕。與假手術組比較，模型組大鼠CVF 和PVCA 均顯著升高(P< 0.01)；與模型組比較，卡托普利組大鼠CVF和PVCA均顯著下降(P<0.01)。見圖1、表1。

A、D、G：假手術組；B、E、H：模型組；C、F、I：卡托普利組

2.4 TNF-α測定結果 造模8周時，與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α濃度明顯增高(P< 0.01)；與模型組比較，卡托普利組大鼠血清TNF-α濃度顯著降低(P< 0.01)。見表1。

組別HWI(mg/g)LVWI(mg/g)CVF(%)PVCA(%)血清TNF?α(pg/ml)假手術組2．63±0．132．08±0．113．55±0．370．61±0．067．31±0．72模型組3．23±0．25?2．75±0．20?7．04±0．65?1．58±0．19?25．77±0．94?卡托普利組2．82±0．32#2．29±0．29#4．21±0．27#0．93±0．13#11．83±0．84#

注：與假手術組比較，*P< 0.01；與模型組比較，#P< 0.01

3 討論

心室重構是原發性高血壓導致的重要靶器官損害，是心臟功能由代償走向失代償的重要病理基礎[3]。神經體液因素在心室重構發生發展過程中起著關鍵作用，以TNF-α為代表的促炎細胞因子與心血管系統疾病密切相關。研究顯示，高血壓患者血清促炎細胞因子表達顯著上調，并且促炎細胞因子與高血壓預后密切相關[4]。

TNF-α主要由單核-巨噬細胞分泌[5]，另有研究發現心肌細胞本身也是TNF-α分泌的主要來源[6]，壓力負荷可誘導這些細胞表達TNF-α。Nagueh等[7]研究發現壓力負荷可造成TNF-α分泌，長時間TNF-α刺激可導致心肌纖維化和心肌肥厚。TNF-α可通過多種方式調節心肌纖維化。TNF-α可促進心臟成纖維細胞增殖[8]，直接作用于成纖維細胞，導致膠原纖維合成和分泌增多，并上調成纖維細胞上的血管緊張素Ⅱ1型受體，從而增加血管緊張素Ⅱ促纖維化的作用[9]，TNF-α還可通過動態調控金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶組織抑制劑的比值而影響膠原的降解，并可通過上調轉化生長因子-β的表達而間接地促進心肌纖維化[10]。

本結果表明，模型組HWI和LVWI高于假手術組；模型組CVF 和PVCA較Sham組增加；Model組血清TNF-α較假手術組增加，提示膠原網絡增生并參與壓力負荷增加下的心室重構；可能是壓力增加導致心肌組織中TNF- α mRNA轉錄和蛋白合成增加，進入血液循環中的TNF-α增加，進一步通過上述途徑刺激心肌纖維化產生。造模成功后進一步給予卡托普利100 mg·kg-1·d-1灌胃4周后發現，結果顯示，與模型組比較，卡托普利組HWI和LVWI、CVF 和PVCA以及血清TNF-α明顯降低。因此，可以認為卡托普利可通過降低壓力負荷增加大鼠血清TNF-α水平改善心肌纖維化。

1 Rosello-Lleti E,Rivera M,Martinez-Dolz L,et al.Inflammatory activation and left ventricular mass in essential hypertension.Am J Hypertens,2009,22:444-450.

2 Anversa P,Olivetti G,Melissari M,et al.Morphometric study of myocardial hypertrophy induced by abdominal aortic stenosis.Lab Invest,1979,40:341-349.

3 Buja LM,Vela D.Cardiomyocyte death and renewal in the normal and diseased heart.Cardiovasc Pathol,2008,17:349-374.

4 Pedrinelli R,Dell'Omo G,Di Bello V,et al.Low-grade inflammation and microalbuminuria in hypertension.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:2414-2419.

5 趙智明,蔡佳玉,焦冬冬,等.淫羊藿總黃酮對充血性心力衰竭大鼠血漿TNF-α的影響.安徽中醫學院學報,2010,29:59-63.

6 Zhang J,Cheng X,Liao YH,et al.Simvastatin regulates myocardial cytokine expression and improves ventricular remodeling in rats after acute myocardial infarction.Cardiovasc Drugs Ther,2005,19:13-21.

7 Nagueh SF,Stetson SJ,Lakkis NM,et al.Decreased expression of tumor necrosis factor-alpha and regression of hypertrophy after nonsurgical septal reduction therapy for patients with hypertrophic obstructive cardiomyopathy.Circulation,2001,103:1844-1850.

8 Venkatachalam K,Venkatesan B,Valente AJ,et al.WISP1,a pro-mitogenic,pro-survival factor,mediates tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha)-stimulated cardiac fibroblast proliferation but inhibits TNF-alpha-induced cardiomyocyte death.J Biol Chem,2009,284:14414-14427.

9 Peng J,Gurantz D,Tran V,et al.Tumor necrosis factor-alpha-induced AT1 receptor upregulation enhances angiotensin II- mediated cardiac fibroblast responses that favor fibrosis.Circ Res,2002,91:1119-1126.

10 Sivasubramanian N,Coker ML,Kurrelmeyer KM,et al.Left ventricular remodeling in transgenic mice with cardiac restricted overexpression of tumor necrosis factor.Circulation,2001,104:826-831.

·消 息·

本刊對統計學符號及統計學方法的要求

本刊編輯部

EffectofcaptoprilontheexpressionlevelsofserumTNF-αinratswithpressureoverload

ZHAOZhiming,ZHANGJing,DONGXiaolei,etal.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Nanjing210002,China

ObjectiveTo observe the effect of captopril on the expression levels of serum TNF-αin rats with pressure overload.MethodsThe animal models with pressure overload myocardial fibrosis were established by abdominal aorta constriction in Sprague-Dawley (SD) rats.The rats were randomly divided into three groups:sham-operation group,model group and captopril group.After 4 weeks,the models were successfully established and the rats were given drugs,with a treatment course of 4 weeks.After 8 weeks the heart mass index and left ventricular mass index were measured,left ventricular myocardial pathological changes were observed by means of HE staining,left ventricular myocardial collagen forms were observed by means of Masson staining,and image analysis collagen volume fraction (CVF) and perivascular collagen area (PVCA) were measured by image analysis,and the levels of serum TNF-α were detected by ELISA.ResultsAs compared with those in sham-operation group,the heart mass index and left ventricular mass index were significantly increased in model group (P<0.01);as compared with those in model group,which in captopril group were significantly decreased (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,CVF and PVCA in model group were significantly increased (P<0.01); as compared with those in model group,which in captopril group were significantly decreased (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,the serum levels of TNF-αwere obviously increased in model group (P<0.01);as compared with those in model group,which in captopril group were significantly decreased (P<0.01).ConclusionThe captopril has the effect of regressing myocardial fibrosis.

captopril; pressure load;TNF-α;rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.008

210002 南京市,中國人民解放軍南京軍區南京總醫院中西醫結合科

蔡輝，210002 中國人民解放軍南京軍區南京總醫院；

E-mail：caihuiphd@163.com

R 542.23

A

1002-7386(2014)05-0665-03

2013-10-18)