辛伐他汀對糖尿病大鼠血脂和血小板膜糖蛋白表達水平的影響

楊薇 黎小妍 劉玉興 張立建 錢興國

糖尿病是心腦血管病的重要危險因素，血管病變是2型糖尿病的重要并發癥，由于血小板活化異常導致高凝、微血栓形成，最終引起血管閉塞[1]。最近有研究表明，羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑(即他汀類藥物)除了能降低血漿膽固醇水平外，還可以抑制血管平滑肌細胞增殖，穩定斑塊，抑制血小板凝聚和血栓形成以及抗炎癥反應[2]。因此，本研究觀察了他汀類藥物辛伐他汀對鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病大鼠血小板膜糖蛋白水平的影響，探討該類藥物對糖尿病心腦血管并發癥的保護作用。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

STZ由美國Sigma公司提供；辛伐他汀由默沙東中國有限公司生產，批號J20120012；總膽固醇、甘油三酯、HDL、LDL測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；FITC標記的大鼠CD61抗體， PerCP標記的大鼠CD63抗體，PE標記的大鼠CD41、CD62p抗體均購于美國PHARMINGEN公司；流式細胞儀為Coulter公司的EPICS ELITERESP型；采用德國羅氏血糖儀檢測大鼠血糖。

二、動物和分組

50只雌性Wistar大鼠 (由廣東省實驗動物中心提供)，體質量200～250 g，適應性喂養1周后，隨機取10只分為對照組，其余40只給予高脂飼料(正常飼料+10%甘油三酯+2%膽固醇)喂養，8周后，禁食12 h，單次腹腔注射55 mg/kg STZ(溶媒為0.1mmol/L無菌枸櫞酸緩沖液)。1周后取尾靜脈血測血糖，血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病造模成功，成功后繼續給予高脂飲食，對照組注射等量的枸櫞酸緩沖液。共得造模成功高血糖大鼠24只，將其隨機分成糖尿病組12只(死亡2只，最后為10只)；辛伐他汀組12只(死亡2只，最后為10只)，用辛伐他汀混懸液灌胃，20 mg/(kg·d)，共用12周。每周監測大鼠血糖，12周后處死大鼠檢測血小板膜糖蛋白等各項指標。

三、觀察指標

1.生化指標測定

喂養12周后處死大鼠，經頸動脈取血4 ml，高速離心后分離血清，用生化分析儀測定總膽固醇、甘油三酯、HDL和LDL，按試劑盒說明書的具體步驟進行操作。

2.血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、CD41、CD61的測定

用流式細胞儀測定CD62p、CD63、CD41、CD61水平：抽取大鼠靜脈血4 ml緩慢加入 3.8% 枸櫞酸鈉1∶9抗凝，混勻后1 200 r/min離心8 min。另取兩只試管，抽取50 μl血小板混懸液分為4個試管，分別加入FITC標記CD61抗體，PerCP標記大鼠CD63，PE標記CD41、CD62p一抗，避光室溫孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入二抗，室溫孵育30 min，PBS洗脫，最后加入0.2 ml PBS混勻上機測定。

四、統計學處理

結 果

一、糖尿病、辛伐他汀及對照組血脂水平的比較

12周后糖尿病組大鼠血漿總膽固醇、甘油三酯和 LDL水平較對照組高，而HDL水平則較對照組低，比較差異有統計學意義(P<0.01)；辛伐他汀組總膽固醇、甘油三酯和 LDL水平較糖尿病組低，而HDL水平則較糖尿病組高(P<0.01)。見表1。

二、糖尿病、辛伐他汀及對照組血小板膜糖蛋白水平的比較

12周后糖尿病組血小板膜糖蛋白CD62p和CD63表達水平較對照組高，比較差異有統計學意義(P<0.01)；辛伐他汀組膜糖蛋白CD62p、CD63的表達水平較糖尿病組低(P<0.01)，與對照組比較則差異無統計學意義(P>0.05)。3組之間血小板膜糖蛋白CD61、CD41的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 糖尿病、辛伐他汀及對照組血脂水平比較

表2 各組大鼠血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、CD61和CD41表達水平 (%)

討 論

2型糖尿病的發病主要與胰島素敏感性降低和胰島素分泌障礙有關，其最主要的并發癥是心腦血管病變，胰島素抵抗或高胰島素血癥均可導致內皮細胞功能障礙，使纖溶活性、血小板凝集性增強，纖維蛋白原明顯增多，導致動脈粥樣硬化形成，同時大量細胞因子及受損的血管內皮細胞均可使血小板活化，聚集形成病理性血栓[3-4]。血小板在正常情況下是處于“靜止”狀態，但是當血管內皮損傷或處于某些病理狀態時，血小板活化，血小板一旦被激活，其由通常的光盤形狀改變成為球狀，黏附至內皮細胞上，當相互黏附致過度聚集時，便導致血栓形成。血小板的黏附主要是由血小板膜糖蛋白介導，它們起著連接纖維蛋白原的作用，極大地促進血小板聚集和血栓的形成，因此，如果抑制血小板膜糖蛋白的表達，就可抑制血小板的激活，減弱凝血系統的活化對預防糖尿病心腦血管并發癥的發生發展具有重要作用，其中最主要的血小板膜糖蛋白有CD62p、CD63和CD41/CD61(GPIIb/IIIa)等[5-6]。CD62p存在于靜息血小板的α顆粒內，主要參與介導白細胞與內皮細胞的起始黏附、滾動、聚集及活化并釋放炎癥介質，參與了炎癥過程，是目前所知最能反映血小板活化程度的特異指標之一。研究證實，在糖尿病狀態下，CD62p表達的血小板顯著增加，同時CD62p在糖尿病腎病和神經病變的發生與發展中也起重要作用[7-8]。CD63為血小板內溶酶體顆粒膜蛋白，在靜息狀態下血小板表面僅有極少量表達，血小板活化時可隨脫顆粒反應而大量表達在血小板表面，并介導中性粒細胞對活化內皮的黏附，是檢測血小板活化的理想指標，它不僅是活化血小板的特征性分子指標之一，而且在血栓形成中起重要作用，大量研究表明，2型糖尿病患者血小板因子CD63異常升高[9]。CD41/CD61是以活性狀態存在于未被激活的血小板上，并不與黏附蛋白結合，但是當血管內皮受損后，血小板黏附在內皮細胞上，血栓素A 等誘導劑通過不同的細胞內信號改變CD41/CD61立體構型，使之激活，加速了血小板的黏附與聚集[7,10]。

大規模臨床研究證明，他汀類藥物不僅有調脂作用, 而且有重要的非調脂作用和對血管的直接效應，他汀類藥物可影響凝血系統，對防治血栓形成并減少心血管事件發生有良好的作用，研究證實他汀類藥物抑制血小板聚集的作用可能與下調血小板膜上的膽固醇水平，從而改變膜的流體性有關，但其抗血小板和血栓的作用很難用調脂解釋[2,10]。本研究目的是了解他汀類藥物辛伐他汀對糖尿病大鼠血脂水平和血小板膜糖蛋白水平的影響，結果證實辛伐他汀可以調節糖尿病大鼠的血脂水平，同時辛伐他汀可以抑制糖尿病大鼠血小板膜糖蛋白CD62p和CD63表達水平的升高，而CD41/CD61在對照組和糖尿病組之間沒有差異，原因可能是血小板靜息狀態時已經表達大量的GPIIb-IIIa復合物，CD41/CD61是以活性狀態存在于未被激活的血小板上，血小板激活活化后，不同的細胞內信號改變CD41/CD61立體構型，使之激活，其數量并沒有發生改變，所以膜內外轉位的糖蛋白對CD41/CD61影響不大，另外有研究顯示2 型糖尿病伴血管病變組CD62p 顯著高于無血管病變組及健康對照組，2型糖尿病伴血管病變、無血管病變和正常對照組之間的CD41/CD61差異無統計學意義[11]。辛伐他汀通過抑制CD62p和CD63的表達、減少炎癥反應，阻止或延緩糖尿病心腦血管并發癥的發生，其可能的原因為在高血糖誘導的炎癥作用下，轉錄因子活化增強，大量從胞質轉移到胞核，從而促進CD62p基因的表達，而他汀類藥物通過激活二酰基甘油激酶(DGK)，從而抑制轉錄因子轉位，導致下游CD62p基因的轉錄減少[12]。

綜上所述，血小板膜糖蛋白的表達和糖尿病及其并發癥有密切的聯系，他汀類藥物除了調脂的作用以外，還能通過減少CD62p和CD63的表達實現保護血管內皮功能、抑制血管平滑肌生長和抗凝血等作用，實現其非調脂作用的多效性，這從新的角度闡明他汀類藥物對糖尿病心血管事件保護作用機制，為臨床合理使用他汀類藥物提供實驗依據。

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