無錫女性MTHFR和MTRR基因多態性研究

田宇 胡玉芝 魯衍強 馬少杰 楊琦

葉酸為水溶性B族維生素，在體內主要參與一碳單位的轉運，是核酸合成的必要元素，也是細胞生長和組織修復必需物質。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸轉運和代謝的關鍵酶。MTHFR基因C677T位點、A1298C位點與MTRR基因A66G位點的多態性會影響MTHFR與MTRR的酶活性降低，造成葉酸代謝異常，阻礙同型半胱氨酸轉化成甲硫氨酸，引起高同型半胱氨酸血癥，臨床上會增加孕婦生產神經管畸形胎兒、唇腭裂胎兒、唐氏綜合征胎兒與先天性心臟病胎兒的風險[1-5]。為此，本研究對無錫市育齡婦女葉酸代謝基因MTHFR和MTRR相關位點多態性分布進行分析，了解無錫地區婦女葉酸代謝相關基因的分布特點與群體遺傳學特征，為本地區預防出生缺陷制定針對性的干預措施提供科學依據。

對象與方法

一、研究對象

選取無錫市2009年3月至2012年6月在無錫虹橋醫院進行孕前與孕期檢查的無親緣關系女性，根據知情同意原則，經受檢者本人同意后，采集其口腔黏膜細胞進行后續研究。對所有口腔黏膜細胞進行基因組DNA抽提，排除抽提不符合要求者，共獲得有效樣本524例，其中，漢族521例，少數民族3例。樣本提供者年齡(27.0±4.8)歲。

二、方 法

采集受檢者的口腔黏膜上皮細胞，利用硅膠吸附方法抽提樣本的基因組DNA。采用熒光定量PCR技術，分別檢測分析葉酸代謝相關的3個DNA單核苷酸多態性位點(MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G)。每個反應體系總體積10 μl，包含20 ng/μl的模板DNA 1 μl， Taqman通用混合物5 μl， Taqman-MGB探針0.5 μl，去離子水3.5 μl。其中，MTHFR C667T、A1298C與MTHRR A66G具體探針信息見表1，相關儀器、試劑均購自美國ABI公司。反應條件為95℃預熱10 min，其后，擴增20個循環，每個循環92℃變性15 s，60℃延伸1 min，再改變條件擴增30個循環，每個循環89℃變性15 s， 60℃延伸90 s。反應完成后，在ABI7900 型熒光定量 PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結果。

表1 Taqman-MGB探針所在位置

三、統計學處理

對研究人群進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗后，采用SPSS 18.0軟件對所有數據進行統計分析，并將無錫地區3個基因多態性位點的分布頻率分別與山東省[6]、河南省[6]、廣東省[7]、海南省[6]等地區的多態性分布頻率相比較，兩地區間的基因多態性頻率分布的差異比較采用行×列χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因分型

基因組樣本經熒光定量PCR反應后，所得結果利用分析軟件分析確定各樣本基因型，結果見圖1，從左往右依次是MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G。

圖1 基因分型圖

二、Hardy-Weinberg平衡分析

無錫女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果均為優良(C677T：χ2=0.525，P>0.05；A1298T：χ2=1.8，P>0.05；A66G：χ2=0.341，P>0.05)，樣本具有區域群體代表性。

三、無錫女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點基因多態性分布頻率域特點

1.MTHFRC677T

無錫女性MTHFR基因 C677T位點TT基因型的分布頻率為18.9%，低于CC基因型(35.3%)和雜合子CT基因型(45.8%)，純合子基因型的分布情況與山東省、河南省該基因位點多態性的分布情況相反；與廣東省、海南省的基因多態性分布類似，其TT基因型的出現頻率高于廣東省(7.4%)和海南省(9.4%)，比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。MTHFR C677T等位基因的構成與上述4個地區比較差異均有統計學意義(P均<0.01)，見表1。

表2 無錫地區與其他地區女性MTHFR C677T位點基因型頻數和頻率分布比較 例(%)

2.MTHFRA1298C

MTHFR基因A1298C位點的基因型構成與廣東省和海南省的基因型構成比較差異有統計學意義(P<0.01)。A1298C位點無錫女性的CC基因型出現頻率為3.4%，低于廣東省(5.3%)和海南省(6.9%)。無錫女性中，A1298C位點A等位基因的出現頻率(82.7%)遠高于C等位基因(17.3%)。等位基因構成與山東省、河南省的數據比較差異均無統計學意義(P>0.05)，與廣東省和海南省的等位基因構成比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 無錫地區與其他地區女性MTHFR A1298C位點基因型頻數和頻率分布比較 例(%)

3.MTRRA66G

MTRR基因A66G位點G等位基因的出現頻率為24.9%，低于A等位基因(75.1%)；其中純合子GG基因型的出現頻率為6.7%，低于海南省(9.1%)。A66G位點基因型的構成與海南省比較差異有統計學意義(P<0.01)，與其他3個地區數據比較差異均無統計學意義(P>0.05)。等位基因構成與山東省、河南省的數據比較差異均無統計學意義(P>0.05)，與廣東省和海南省的等位基因構成比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 無錫地區與其他地區女性MTRR A66G位點基因型頻數和頻率分布比較 例(%)

討 論

近年來，我國出生病死率有所下降，但出生缺陷率卻逐年增高。目前認為，MTHFR與MTRR這兩個葉酸代謝過程中的關鍵酶，其酶活性水平與人體內葉酸濃度、血漿同型半胱氨酸濃度均密切相關。如果MTHFR與MTRR酶的活性降低或濃度降低，則人體內的同型半胱氨酸水平增高，可引起神經管缺陷、唇腭裂、唐氏綜合征、先天性心臟病等各種出生缺陷。其中神經管缺陷是發生率最高的一類多基因遺傳疾病[8]。MTHFR C677T位點的TT基因型是神經管畸形發生的遺傳高風險因素，TT基因型個體的MTHFR活性會比正常個體下降60%～70%，增加出生缺陷的風險[9-10]。MTHFR A1298C的CC基因型與MTRR A66G的GG基因型[13-14]也是出生缺陷的遺傳風險因素[11-14]。此外，出生缺陷的病因學研究還表明，出生缺陷的發生除了與遺傳因素相關，也受環境因素(營養因素)影響，它是遺傳因素與環境因素共同作用的結果。即對由于MTHFR和MTRR風險基因造成其自身葉酸代謝障礙的女性人群，如果和正常人群一樣補充同劑量的葉酸，則其體內的血清和紅細胞葉酸濃度就會低于正常人群，分娩出生缺陷嬰兒的風險就會增高；但如果對這類女性增加葉酸的補服劑量，就可以維持她們體內正常的血清葉酸水平，降低出生缺陷的發生[15]。

本研究首次收集無錫地區500多名婦女的遺傳樣本，對MTHFR和MTRR基因相關位點進行遺傳檢測。結果顯示，無錫市婦女葉酸代謝相關基因多態性具有地區差異。其MTHFR基因C677T位點的TT型風險基因的分布頻率為18.9%，高于廣東省、海南省的TT基因型的分布頻率(10%左右)，而無錫市2011年圍生兒出生缺陷監測結果顯示，無錫市2011年出生缺陷率為4.98‰ ，遠低于同期廣東省和海南省9.89‰的出生缺陷率[16-19]。無錫市婦女MTHFR A1298C與MTRR A66G基因多態性的分布情況與山東省、河南省相似，無錫市的出生缺陷率也低于山東省12.46‰與河南省(2007年)9.17‰的出生缺陷率[20-21]。這與無錫市積極推廣婦女孕前及孕后葉酸普服項目和擁有相對較高的產前篩查和診斷水平密切相關。因此，積極開展的出生缺陷高危因素的篩查，并提前實施相對應的有效干預措施(如補服葉酸)，可降低出生缺陷的發生率。

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