益腎蠲痹丸對腎虛證與脾虛證膠原誘導性關節炎大鼠的療效比較

肖 誠 ，趙宏艷 ，王 燕 ，劉梅潔 ，王少君 ，潘靜華 ，呂 誠 ，呂愛平 ，鞠大宏 ?

（1．中日友好醫院 臨床醫學研究所，北京 100029；2．中國中醫科學院 中醫基礎理論研究所，北京 100700；3．民航總醫院 病理科，北京 100123；4．中國中醫科學院 中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700）

辨證論治是中醫藥治病的優勢所在，建立切實符合疾病發病內在本質的動物模型的制作方法，對中醫學的發展具有重要意義。類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表現，屬于自身免疫炎性疾病，屬中醫學“痹證”范疇。現代研究表明，腎虛和脾虛在RA的發展中有著重要的作用。因此我們課題組對腎虛證及脾虛證RA大鼠模型的造模方法進行了大量研究[1～6]。

基于對腎虛證及脾虛證RA模型的研究基礎，結合中醫辨證論治的基本診療思路，本實驗欲通過觀察益腎蠲痹丸對兩種證型膠原誘導性關節炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠膝關節骨破壞程度及對腎虛與脾虛狀態的影響，對前期制作的腎虛證及脾虛證CIA動物模型進行驗證，并從基礎研究方面對辨證論治有進一步的闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選用6周齡雌性SPF級SD大鼠114只，由中國藥品生物制品檢定所提供，動物許可證號：SCXK（京）2005-0004。在中國中醫科學院中醫基礎理論研究所清潔級動物室喂養，實驗動物室許可證號：SYXK（京）2005-0024。

1.1.2 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑、大鼠抗牛Ⅱ型膠原試劑盒：美國Chondrex公司產品，批號：100028、100106和121109；羥基脲：齊魯制藥有限公司，批號：810025LC；益腎蠲痹丸：江蘇正大清江制藥有限公司；大鼠皮質酮試劑盒：德國DRG公司產品，批號：61k059；細胞增殖檢測試劑盒：美國 BioVision公司產品，批號：40501；FITC anti-rat CD3、PE anti-rat CD4、PerCP anti-rat CD8a： 美國BioLegend 公司產品， 批號：B126921，B124011，B134493；Leica DM6000B生物顯微鏡：德國Leica公司產品；Multiskan Mk3酶標儀、Wellwash 4 Mk2洗板機：美國Thermo公司；EPICS XL型流式細胞儀：美國Beckman Coulter公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為以下10組：正常對照組10只、假手術組10只、CIA對照組12只、CIA治療組12只、腎虛證（去勢法）CIA組11只、腎虛證（去勢法）CIA組治療組11只、腎虛證（羥基脲法）CIA組12只、腎虛證（羥基脲法）CIA治療組12只、脾虛證 （利血平法）CIA組12只、脾虛證（利血平法）CIA治療組12只。

CIA組、CIA治療組：按前期方法[1]進行造模，即取適量牛Ⅱ型膠原溶液（濃度為2mg/ml）逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，冰浴中用勻漿器充分乳化，以滴入水中不擴散為度，取乳化后的混合物按0.2ml/只，于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml/只，于尾根部皮下加強免疫一次。去勢CIA組、去勢CIA組治療組：按常規方法[7]做去勢手術，即摘除雙側卵巢，假手術組大鼠只摘除雙側卵巢附近的脂肪組織；術后28d，去勢CIA組再按上述方法進行CIA模型復制。羥基脲CIA組、羥基脲CIA治療組：大鼠給予羥基脲（375 mg/kg/d）灌胃[8，9]，灌胃 17d后，按上述方法進行 CIA模型復制。利血平CIA組、利血平CIA治療組：大鼠給予利血平（0.5mg/kg/d）腹腔注射[10]，14d 后，按上述方法進行CIA模型復制。

為了保證免疫條件的齊同性，各組均在同一時間免疫。即以免疫時間為基準點，在免疫前28d行去勢手術、免疫前17d灌服羥基脲、免疫前14 d腹腔注射利血平。Ⅱ型膠原免疫18d后，從每組篩選出10只關節炎指數≥1分大鼠，開始給藥。各治療組均灌胃給予益腎蠲痹丸（3.67g/kg/d）[6]，1次/d，連續4周，其余各組灌以等容積生理鹽水。

關節炎指數評分：參照5級評分法評價[11]，將2只后踝關節的病變程度累計積分，計算出關節炎指數。0分：無關節炎；1分：小趾關節輕度腫脹；2分：小趾關節和足跖腫脹；3分：踝關節以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節在內全部關節腫脹。

1.2.2 取材

戊巴比妥鈉麻醉下，采用腹主動脈取血，分別用于T淋巴細胞亞群的檢測及血漿的制備，取血后立即取出腎上腺稱重，制備的血漿及腎上腺于-80℃冰凍備用。取雙側膝關節，置于福爾馬林中固定備用。

1.2.3 指標的測定

（1）一般狀態觀察：觀測大鼠體重、被毛、活動及排便狀況等。

（2）關節切片及光鏡下關節破壞半定量分析方法：關節于5%HNO3脫鈣1周后，常規石蠟切片及HE染色。光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變，并進行關節病理損傷半定量分析[12]。0分：關節結構正常，關節間隙均勻，軟骨、骨無損傷，滑膜組織無炎癥、增生等；1分：關節結構基本正常，有滑膜增生，血管數量增加，可見少量炎細胞浸潤，軟骨表層輕度破壞；2分：關節軟骨有明顯的侵蝕破壞，血管翳形成，炎細胞浸潤明顯，無骨破壞，關節間隙基本正常；3分：有大量的血管翳形成，可見廣泛的軟骨的侵蝕破壞，可見骨破壞，關節結構遭破壞。

（3）血漿抗Ⅱ型膠原抗體、血漿皮質酮（corticosterone，CORT）含量測定：均采用酶聯免疫吸附法檢測，具體操作方法按試劑盒說明書進行。

（4）腎上腺環磷腺苷酸（cAMP）、環磷鳥苷酸（cGMP）含量測定： 取大鼠雙側腎上腺，稱重后，按說明書所示方法制備樣品，采用放射免疫法測定cAMP、cGMP含量。

（5）外周血T淋巴細胞亞群的檢測：分別用FITC、PE、PerCP 標記的抗大鼠 CD3+、CD4+、CD8+單抗，對全血中淋巴細胞進行免疫熒光染色，室溫下避光反應40min，加入紅細胞裂解液2ml，5min后加入 5ml D-Hank’s，350g離心 5min洗 2遍，加入500μl D-Hank’s，混勻后上流式細胞儀檢測。收集4000個細胞用于數據分析。

（6）脾淋巴細胞增殖的檢測：無菌取脾制成淋巴細胞懸液，用1640培養液調整脾細胞濃度為2×106/ml，取 50μl加入 96 孔板，每只動物脾細胞懸液平行設9個復孔，分為3組，即刀豆球蛋白A（ConA，10μg/ml）組、脂多糖（LPS，4μg/ml）組和正常對照組，每組3個復孔。然后分別加入ConA、LPS和 1640培養液各 50μl。于 37℃、5%CO2的培養箱中培養。48h后，每孔加入10μl WST-1溶液，在培養箱內繼續孵育4h，于酶標儀中記錄吸光度（OD450nm/630nm）。細胞增殖反應以 ConA或LPS刺激指數表示，即實驗孔與對照孔吸光度的比值。

1.2.4 統計學處理

應用SPSS13.0統計學軟件，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 益腎蠲痹丸對各組CIA大鼠行為學的影響

正常對照組與假手術組：大鼠精神狀態良好，被毛光澤，飲食正常，活動自如。

CIA組：大鼠精神狀態良好，被毛光澤，飲食正常，體重略有下降，踝關節紅腫，活動受限。

去勢CIA組：大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，體毛枯疏，飲食正常，喜扎堆，踝關節紅腫，活動減少。

去勢CIA治療組：大鼠精神狀態良好，弓背蜷縮，體毛枯疏，飲食正常，扎堆現象減少，踝關節紅腫程度減輕，活動減少。

羥基脲CIA組：大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，被毛無光澤，四肢發涼、發白，體溫下降，喜扎堆，飲食減少，肛周污穢，踝關節腫脹，懶動。

羥基脲CIA治療組：大鼠精神萎靡，弓背蜷縮，被毛無光澤，飲食尚可，體溫較羥基脲CIA組有所上升，喜扎堆現象略有減少，踝關節紅腫程度減輕，懶動。

利血平CIA組：大鼠精神萎靡，瞇眼，被毛枯疏無光澤，弓背蜷縮，踝關節紅腫，倦怠、懶動，喜聚堆，飲食減少，體重下降，便溏。

利血平CIA治療組：大鼠精神萎靡，瞇眼癥狀減輕，被毛枯疏無光澤，弓背蜷縮，踝關節紅腫略有減輕，倦怠、懶動，喜聚堆，體重下降，稀便。

2.2 益腎蠲痹丸對各組CIA大鼠膝關節病理損傷的影響

光鏡觀察結果顯示：正常對照組與假手術組：膝關節結構正常，關節軟骨表面光滑，軟骨基質及軟骨細胞無退行性變，滑膜組織無增生，關節軟骨下骨小梁大小、排列未見異常。CIA對照組、羥基脲CIA組、去勢CIA組及利血平CIA組：關節腔內可見程度不同的滑膜組織增生，血管翳形成，其內見有擴張的血管、新生毛細血管及成纖維細胞，并伴有淋巴細胞浸潤。關節軟骨及軟骨下骨見不同程度的侵蝕破壞，關節結構破壞。CIA治療組、羥基脲CIA治療組、去勢CIA治療組和利血平CIA治療組：分別與相應模型組比較，滑膜細胞增生減輕，血管增生和浸潤炎細胞數量減少，血管翳形成減少，骨質破壞有所減輕。

膝關節病理損傷積分結果表明：各組CIA大鼠膝關節病理積分顯著升高（P＜0.05）。與羥基脲CIA組相比，益腎蠲痹丸治療后大鼠膝關節病理積分顯著下降（P＜0.05）；與去勢CIA組相比，益腎蠲痹丸治療后大鼠膝關節病理積分亦顯著下降（P＜0.01）；與利血平CIA大鼠相比，益腎蠲痹丸治療后大鼠膝關節病理積分雖降低，但無統計學意義（見圖 1）。

2.3 益腎蠲痹丸對各組CIA大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體的影響

與正常對照組相比，各CIA組及給藥組抗Ⅱ型膠原抗體含量顯著升高（P＜0.01）；與CIA對照組相比，去勢CIA組、羥基脲CIA組、利血平CIA組CⅡ含量顯著升高（P＜0.01）；益腎蠲痹丸能顯著下調各證型CIA大鼠抗Ⅱ型膠原抗體含量（P＜0.05，P＜0.01）（見表 1）。

2.4 益腎蠲痹丸對CIA大鼠腎虛指標的影響

2.4.1 益腎蠲痹丸對CIA大鼠血漿CORT含量的影響

CIA對照組CORT含量與正常對照組相比，無顯著性差異。與CIA對照組相比，去勢CIA組及羥基脲CIA組大鼠CORT顯著下降 （P＜0.05）；與去勢CIA組相比，去勢CIA治療組CORT顯著升高（P＜0.05）；羥基脲CIA治療組與羥基脲CIA組比較，無顯著性差異（見表2）。

2.4.2 益腎蠲痹丸對腎上腺cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP的影響

圖1 各組大鼠膝關節病理損傷積分（x±s，n=10）

CIA對照組 cAMP、cGMP和 cAMP/cGMP與正常對照組相比，無顯著性差異。與CIA對照組相比，去勢CIA及羥基脲CIA組cAMP含量顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），去勢 CIA 組 cGMP 含量顯著升高（P＜0.05），羥基脲CIA組cGMP含量無顯著性改變，而去勢CIA組及羥基脲CIA組大鼠cAMP/cGMP均顯著下降（P＜0.01）。與羥基脲CIA組相比，治療后cAMP、cGMP及AMP/cGMP有升高趨勢，但均無統計學意義。與去勢CIA組相比，去勢CIA治療組cAMP/cGMP顯著升高（P＜0.01）（見表 2）。

2.5益腎蠲痹丸對CIA大鼠脾虛指標的影響

2.5.1益腎蠲痹丸外周血T淋巴細胞亞群測定

CIA對照組大鼠外周血中CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞百分比與正常對照組相比，無顯著性差異，但 CD4/CD8顯著升高（P＜0.05）。 與 CIA對照組相比，利血平CIA組CD3+細胞、CD4+細胞百分比顯著下降 （P＜0.05），CD8+細胞百分比和CD4/CD8無顯著變化。益腎蠲痹丸治療前后，利血平CIA大鼠CD4/CD8亦無顯著性差異 （見表3）。

2.5.2 脾臟淋巴細胞增殖的檢測

表1 各組大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體水平（n=10）

表2 各組大鼠血漿CORT、腎上腺cAMP、cGMP與cAMP/cGMP的變化（n=10）

表3 各組大鼠外周血T淋巴細胞亞群變化（n=10）

表4各組大鼠脾臟淋巴細胞刺激指數的變化（n=10）

與正常對照組相比，CIA對照組ConA刺激后的T細胞增殖能力和LPS刺激后B細胞增殖能力顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。 與 CIA 對照組相比，利血平CIA組大鼠T細胞增殖能力顯著下降（P＜0.05），B細胞增殖能力亦顯著下降，但無統計學意義。CIA治療組T細胞和B細胞增殖能力，較 CIA 對照組顯著降低 （P＜0.01，P＜0.05）。與利血平CIA組相比，利血平CIA治療組T細胞增殖能力顯著降低 （P＜0.05），B細胞增殖能力無顯著性差異（見表4）。

3 討論

RA屬中醫學“痹病”的范疇，本病的病因病機是正氣虧虛，營衛不和，邪氣趁虛而入，流注筋骨，搏結關節，而發為痹痛。中醫專家朱良春根據多年的臨床經驗，認為本病病變在骨，骨為腎所主，故應益腎壯督治其本，蠲痹通絡治其標，從而研制出益腎蠲痹丸。益腎蠲痹丸是具有蠲痹通絡，搜剔病邪的作用，諸藥相合，達到溫補腎陽、益腎壯督、搜風剔邪、蠲痹通絡之功效[12]。因此選用該藥作為本實驗補腎除痹的代表藥物，從以方測證的角度觀察該藥對單純痹癥、腎虛痹癥及脾虛痹癥的療效，為RA病證結合動物模型的制作提供進一步的評判依據。

根據前期研究，制備了腎虛證與脾虛證CIA大鼠模型[3，4]。經益腎蠲痹丸治療后，各組大鼠膝關節損傷均有不同程度的改善，但CIA對照組及脾虛證CIA大鼠關節改善程度差于腎虛證CIA大鼠；對2種腎虛證CIA關節損傷療效分析發現，益腎蠲痹丸對去勢法制作的腎虛CIA大鼠關節損傷優于羥基脲法制作的腎虛CIA大鼠。抗Ⅱ型膠原自身抗體水平的高低，可反映機體炎癥的嚴重程度[13，14]。對抗Ⅱ型膠原抗體檢測顯示，去勢CIA組大鼠、羥基脲CIA組大鼠、利血平CIA組大鼠血漿抗Ⅱ型膠原抗體含量與CIA對照組大鼠相比顯著升高，說明腎虛與脾虛證候可加重CIA的發病程度；經益腎蠲痹丸治療后，CIA對照組大鼠及不同證型CIA組大鼠抗Ⅱ型膠原抗體水平均有不同程度的下降，其中腎虛CIA大鼠下降最明顯，脾虛CIA大鼠其次，CIA對照組再次。進一步反映益腎蠲痹丸對腎虛證CIA大鼠療效最為明顯。

“下丘腦-垂體-靶腺”軸不同環節、不同程度的功能紊亂是腎虛證的主要病理基礎。糖皮質激素（人類主要為皮質醇，大鼠主要為CORT）是下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）軸終末激素。CORT是腎上腺在應激反應里產生的一種類激素，腎虛證患者腎上腺皮質功能低下，血漿CORT含量降低是診斷腎上腺皮質功能減退的直接證據[15]；cAMP是核苷酸的衍生物，為蛋白激酶致活劑，是有機體中廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質，cGMP跟cAMP一樣，是一種具有細胞內信息傳遞作用的第二信使，其生物效應和 cAMP相反。cAMP和cGMP是一對相互拮抗又相互制約的物質，對于細胞功能處于穩定狀態具有雙向調節作用。目前已有研究通過檢測cAMP/cGMP來探討腎虛的本質[16，17]。實驗研究發現，經益腎蠲痹丸治療后，去勢CIA大鼠腎上腺CAMP/cGMP顯著升高，而羥基脲CIA大鼠腎上腺cAMP/cGMP雖升高，但無統計學意義。經益腎蠲痹丸治療后，去勢CIA大鼠血漿CORT顯著升高，羥基脲CIA大鼠血漿CORT有升高的趨勢。說明益腎蠲痹丸對去勢法制作的腎虛狀態具有更好的調節作用。

T淋巴細胞是細胞免疫的主要效應細胞，也是機體免疫應答的主要調節細胞。用單抗測定外周血白細胞中CD4和CD8陽性細胞百分比，或是兩種細胞的比值，來初步評估機體免疫狀態。有研究表明[18～20]：脾虛證患者出現 CD3+、CD4+T細胞數量及CD4/CD8比值的下降，T細胞亞群的平衡狀態失調，這與脾氣虛弱致抗御外邪的機能降低相一致。T淋巴細胞、B淋巴細胞表面具有絲裂原受體，受非特異性絲裂原（如ConA和LPS）刺激后能分裂增殖，轉化為淋巴母細胞。根據淋巴細胞轉化率可判斷機體的細胞免疫水平和體液免疫水平。研究結果顯示，利血平制作的脾虛模型T、B淋巴細胞增殖能力降低。經益腎蠲痹丸治療后，脾虛CIA大鼠T、B淋巴細胞增殖能力下降，CD4/CD8亦下降，但并無統計學意義，說明益腎蠲痹丸對利血平制作的CIA大鼠的脾虛功能調整作用有限。

益腎蠲痹丸對腎虛證CIA大鼠的療效要優于脾虛證CIA大鼠及CIA對照組大鼠，而去勢所致腎虛CIA大鼠療效要略優于羥基脲所致腎虛CIA大鼠，表明去勢法制作的腎虛證CIA模型可能更符合中醫的腎虛證候動物模型。同時益腎蠲痹丸對腎虛狀態有較好的調節作用，尤其是去勢法所致的腎虛CIA大鼠的調節作用更為顯著，對利血平所致的脾虛功能調整作用有限，以上結果亦為中醫辨證治療的合理性提供了實驗依據。

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