HBV相關肝細胞癌組織中CDC37基因啟動子微衛星多態性及其與基因表達的關系

陳朝武，劉 宇，徐 瑩，楊貴奉，王戰會，姜榮龍

(南方醫科大學南方醫院，廣州510515)

微衛星是一種廣泛存在于生物基因組中的由1～6個核苷酸組成的簡單串聯重復序列，又稱為短串聯重復序列或簡單重復序列。人類基因組中二核苷酸重復序列(CA/GT)n是最為常見的微衛星形式之一，n為重復次數，通常為15～60次。微衛星具有高度的多態性和個體特異性，并且可以穩定遺傳。CDC37蛋白是一種與細胞分裂周期有關的蛋白，能特異性地與未成熟的蛋白激酶結合并進而與熱休克蛋白90結合，使蛋白激酶正確折疊和成熟。CDC37蛋白作為一種重要的蛋白激酶特異性輔助分子伴侶，與腫瘤發生過程中多條信號通路的活化密切相關［1，2］。我們的研究發現，CDC37在肝細胞癌(HCC)組織中的表達明顯高于癌旁組織和正常肝組織，那么CDC37基因啟動子區是否存在微衛星多態性，微衛星多態性是否會影響CDC37的表達，從而影響HCC的發生和發展，目前還未見相關報道。為此，我們對乙型肝炎病毒(HBV)相關HCC患者的癌組織和癌旁組織中CDC37基因啟動子序列進行了觀察，并對癌組織和癌旁組織中CDC37啟動子微衛星多態性的組成形式進行了分析。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012～2013年在南方醫科大學南方醫院接受手術治療的HBV相關HCC患者22例，男18例，女4例;年齡28～71歲。術中分別留取其腫瘤組織(HCC組織)及癌旁正常肝組織(癌旁組織)。有13例患者的HCC組織中CDC37表達水平高于相應癌旁組織(CDC37過表達)，9例患者的HCC組織中CDC37表達水平不高于相應癌旁組織(CDC37無過表達)。

1.2 HCC組織及癌旁組織DNA的提取 每例份組織標本稱取30 mg，采用組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN公司)提取基因組DNA，最后用NANO DROP2000檢測所提DNA的純度及濃度。

1.3 CDC37啟動子序列的擴增、克隆、測定及比對以提取的DNA為模板對CDC37啟動子含微衛星區段序列進行PCR擴增。引物序列由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，上游引物序列:5'-ATTATCCTGGT-ATCAAAGCGTG-3'，下游引物序列:5'-GACCTAAGCCTGCGCTGGA-3'。PCR反應體系共30 μL:基因組 DNA 3 μL，10 × Buffer 3 μL，上下游引物各 0.3 μL，dNTP 2.4 μL，Taq 酶 0.3 μL，去離子水20.7 μL。PCR循環參數為94℃預變性5 min后，進行 35 個循環:94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、40 s，最后72℃延伸5 min。

采用PCR產物純化試劑盒(TIANGEN公司)回收、純化PCR產物。將純化后產物與PMD-18T Vector(TaKaRa公司)進行TA克隆連接反應，反應體系共 10 μL(滅菌蒸餾水 1 μL，SolutionⅠ連接緩沖液5 μL，PMD-18T Vector 1 μL，純化 DNA 3 μL)，4 ℃條件下連接12～18 h。將上述連接產物轉化感受態細菌JM109，取適量菌液均勻涂抹于氨芐抗性LB平板上，37℃過夜培養。挑取單克隆培養后PCR鑒定陽性克隆，最后每例組織標本至少送3個克隆進行測序。采用Mega5.05軟件對測序結果進行排列，并與CDC37啟動子參照序列進行比對，對不同組織標本中CDC37啟動子微衛星多態性進行分析。1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。組間微衛星模式分布比較用Fisher確切概率法，兩個率的比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織及癌旁組織中CDC37基因啟動子區微衛星形式 22例患者的癌組織共有93個克隆進行了序列分析，癌旁組織共有101個克隆進行了序列分析。測序結果表明CDC37基因的啟動子區存在(GT)n1-GC-(GT)n2微衛星形式，位于CDC37啟動子區的1 368～1 415位;主要的組成形式中n1有8、9、10共3種重復形式，n2有8～13共6種重復形式;(GT)n1和(GT)n2以多種不同的組合方式存在，其中n1為10的組合方式最為多樣，(GT)10-GC-(GT)9最為常見，其次為(GT)10-GC-(GT)12和(GT)10-GC-(GT)13兩種形式;其中(GT)8-GC-(GT)13、(GT)9-GC-(GT)9、(GT)9-GC-(GT)10、(GT)9-GC-(GT)12、(GT)9-GC-(GT)13、(GT)10-GC-(GT)8、(GT)10-GC-(GT)9、(GT)10-GC-(GT)10、(GT)10-GC-(GT)11、(GT)10-GC-(GT)12、(GT)10-GC-(GT)13、其他形式在HCC組織(共93個克隆)中分別為 0、7、1、4、3、3、31、2、2、17、13、10 個克隆，在癌旁組織(共101 個克隆)中分別為 2、9、1、0、4、4、40、0、0、17、19、5 個克隆。HCC 組織主要有 10 種微衛星組成形式，癌旁組織主要有8種，但兩組之間不同組合形式的微衛星分布相比，P＞0.05。

2.2 CDC37基因啟動子區微衛星形式與CDC37表達的關系 13例份HCC組織中CDC37過表達者，其HCC組織克隆數為66個、癌旁組織克隆數為67個;9例份HCC組織中CDC37無過表達者的HCC組織克隆數為27個。微衛星(GT)9-GC-(GT)9、(GT)9-GC-(GT)10、(GT)9-GC-(GT)12、(GT)9-GC-(GT)13、GT)10-GC-(GT)8、(GT)10-GC-(GT)9、(GT)10-GC-(GT)10、(GT)10-GC-(GT)11、(GT)10-GC-(GT)12、(GT)10-GC-(GT)13、其他形式在 13 例份HCC組織中CDC37過表達者的HCC組織中分別為 6、1、4、2、2、29、2、1、5、8、6 個克隆，在其癌旁組織中分別為 5、1、0、5、4、33、0、0、5、14、1 個克隆，在9例份HCC組織中CDC37無過表達者的HCC組織中分別為 1、0、0、1、1、2、0、1、12、5、4 個克隆。13 例肝癌組織中CDC37過表達者的HCC組織和癌旁組織中微衛星組成形式總體分布相比，P＞0.05。13例CDC37過表達者和9例無過表達者HCC組織中CDC37啟動子微衛星組成形式相比，P＜0.05;其中(GT)10-GC-(GT)9形式在CDC37過表達者中所占比例高于無過表達者，兩者相比，χ2=11.508、P＜0.05，(GT)10-GC-(GT)12形式在 CDC37 無過表達者中所占比例高于過表達者，兩者相比，χ2=15.055、P＜0.05。

3 討論

HCC是一種遺傳與環境共同作用所致的、多基因參與的疾病，HBV和丙型肝炎病毒的感染、含黃曲霉素B1食物的攝入及過度飲酒是HCC發生的主要危險因素［3］，但參與其腫瘤發生的分子機制尚未完全明了。近年來的腫瘤遺傳學研究表明，細胞的惡性轉化與其遺傳物質(基因組)的不穩定性有關，基因組的不穩定性主要表現為雜合性缺失和微衛星不穩定(MSI)。

微衛星序列廣泛存在于真核和原核生物的基因組中，可定位于基因的啟動子、內含子及外顯子等區域，它可引起啟動子區DNA二級結構的改變，并導致與RNA聚合酶和轉錄因子的結合能力發生改變，從而影響基因的表達［4］。微衛星異常是基因組不穩定的重要分子標志，微衛星序列除了參與基因表達調控，還參與基因重排與變異、維持基因組穩定等。微衛星多態性對于腫瘤的早期診斷［5］及腫瘤類型［6］、分期與轉移［7］、預后判斷［8］等都有重要意義。

本研究發現，CDC37基因的啟動子區存在著(GT)n串聯重復序列。作為蛋白激酶特異性的輔助分子伴侶CDC37在腫瘤細胞的生長、分裂、分化過程中起關鍵作用，近年來已成為抗腫瘤藥物研究的熱點，針對CDC37及其復合物抑制劑的研究也在不斷進展中［9］。如果能夠明確CDC37啟動子微衛星多態與其過表達及HCC發生和進展之間的關系，有助于在HCC的發展過程中進行早期診斷和干預。在本研究的整個研究群體中，其CDC37基因的啟動子區(GT)n1-GC-(GT)n2微衛星形式中n1的重復次數在8～10，以10最為常見;n2重復次數為8～13，以9最為常見。(GT)n1-GC-(GT)n2最常見的形式為(GT)10-GC-(GT)9，占36.60%。在 HCC組織和癌旁組織中，(GT)n1-GC-(GT)n2的總體分布沒有統計學差異，最常見的形式都是(GT)10-GC-(GT)9。CDC37過表達的HCC組織與相應癌旁組織微衛星多態性的總體分布亦無統計學差異，最常見的形式都是(GT)10-GC-(GT)9。HCC組織中CDC37過表達者和無過表達者微衛星多態性存在統計學差異，其中(GT)10-GC-(GT)9在過表達者和無過表達者中的比例分別為 43.94%和 7.41%，而(GT)10-GC-(GT)12在兩者中分別占7.58%和44.44%，這兩種多態性在過表達者和無過表達者中的分布都有統計學差異，這種差異是否與CDC37的表達有關有待進一步研究。

研究［10］表明，富含AC/GT的微衛星序列能形成左旋雙螺旋的Z-DNA結構。AC/GT微衛星長度的變化能調控基因的表達［11］，進而影響人類的相關表型［12］。體內外研究［13］表明，血紅素氧化酶-1 啟動子(GT)n序列重復數目的改變可影響其轉錄，長的重復序列可導致低水平表達，但具體機制還不清楚。血紅素氧化酶-1是一種重要的保護因子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及抗增生的作用，其啟動子多態性與心血管并發癥相關［14］。而CDC37基因啟動子區的GT微衛星多態性是否會通過DNA二級結構的變化而影響啟動子的活性，進而影響CDC37的表達，從而影響HCC的發生和發展，目前尚不清楚。本研究只對 CDC37啟動子微衛星多態性與CDC37表達的相關性做初步探討，還需要進一步擴大樣本量加以研究，并通過體外實驗來驗證不同的微衛星形式對其啟動子活性的影響，才能明確該微衛星形式與CDC37表達的關系，并進一步明確其與HBV相關HCC的相關性，為臨床診治HBV相關HCC提供理論依據。

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