乳腺增生丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

徐英宏，張 嫻，齊 軍，楊 君

0 引言

乳腺增生丸是中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院制劑室生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑(批準(zhǔn)文號(hào):遼藥制字Z05010172)，臨床應(yīng)用近40年，其療效確切，長(zhǎng)期使用未見明顯不良反應(yīng)。該制劑由柴胡、白芍、丹參、當(dāng)歸、紅花、川楝子、香附、雞血藤、蒲公英、莪術(shù)、茯苓、白術(shù)、三棱13味中藥組成。以舒肝理氣、調(diào)和氣血、軟堅(jiān)散結(jié)為主要功效。主治乳腺增生，月經(jīng)前后乳房脹痛等癥。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有1味藥材的顯微鑒別和2味藥材的薄層色譜鑒別，不能滿足現(xiàn)代中藥制劑的質(zhì)控要求。為了更好地控制該制劑質(zhì)量，本文采用薄層色譜法(TLC)首次對(duì)該制劑中的雞血藤、當(dāng)歸、蒲公英3味藥材同時(shí)進(jìn)行定性分析，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)乳腺增生丸中綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B和阿魏酸6種有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，為乳腺增生丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善與提高提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(VWD檢測(cè)器、四元梯度泵、在線脫氣裝置、手動(dòng)進(jìn)樣器)；ChemStation工作站(Agilent科技有限公司)；Sartorius CPA225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 試藥與試劑 乳腺增生丸(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20130620、20130820、20131125、20131224、20140327)；雞血藤對(duì)照藥材(批號(hào)：121173-200902)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)：120927-201014)、蒲公英對(duì)照藥材(批號(hào)：121195-200902)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供TLC法鑒別用；丹酚酸B(批號(hào)：111562-201009)、芍藥苷(批號(hào)：110736-201035)、阿魏酸(批號(hào)：110773-201012)、咖啡酸(批號(hào)：110885-200102)、綠原酸(批號(hào)：110753-200413)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用；芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào)：120518，四川省維克奇生物科技有限公司)，供含量測(cè)定用；乙腈、甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為二次重蒸水；磷酸、甲醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正己烷均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠G(青島海洋化工分廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸、蒲公英、雞血藤的TLC鑒別[1-4]

2.1.1 供試品溶液制備 取乳腺增生丸20 g，加適量硅藻土，研細(xì)，加乙醇100 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，放置于室溫，加乙醇4 mL作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備 取當(dāng)歸對(duì)照藥材、蒲公英對(duì)照藥材、雞血藤對(duì)照藥材各0.5 g，加乙醇20 mL，加熱回流1 h，照供試品溶液制備方法操作，制成當(dāng)歸、蒲公英、雞血藤的對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量及工藝要求，分別制備不含當(dāng)歸、蒲公英、雞血藤的陰性對(duì)照樣品，照供試品溶液制備方法操作，分別制成當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液、蒲公英陰性對(duì)照溶液和雞血藤的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 鑒別方法 取3個(gè)批次(20130820、20130620、20131125)的乳腺增生丸供試品溶液、當(dāng)歸、蒲公英、雞血藤對(duì)照藥材溶液，以及當(dāng)歸、蒲公英、雞血藤的陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-正己烷-乙酸乙酯(4∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視，供試品溶液色譜中，在與3味藥材對(duì)照溶液相應(yīng)位置上顯相同的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液色譜中在相應(yīng)的位置上無相應(yīng)斑點(diǎn)(見圖1)。

圖1 乳腺增生丸的薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 溶液的配制 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備：精密稱取芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品11.0 mg、丹酚酸B對(duì)照品50.0 mg、芍藥苷對(duì)照品8.4 mg、阿魏酸對(duì)照品2.00 mg、咖啡酸對(duì)照品4.00 mg、綠原酸對(duì)照品2.00 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液制備：取乳腺增生丸剪碎，精密稱定20 g，用70%乙醇200 mL回流提取1 h，重復(fù)2次，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，用水溶解至100 mL。用石油醚300 mL萃取3次，石油醚層棄去，水層繼續(xù)用乙酸乙酯300 mL萃取3次，將3次萃取所得乙酸乙酯層合并，減壓濃縮至干，用甲醇定容于10 mL量瓶，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存待用。

陰性對(duì)照溶液制備：按處方量及工藝要求，取缺白芍、丹參、當(dāng)歸和蒲公英的其他藥材制成陰性樣品。取陰性樣品20 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.2 色譜條件的選擇[5]波長(zhǎng)的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)，各對(duì)照品的檢測(cè)波長(zhǎng)分別選擇230、280、320 nm。試驗(yàn)顯示，使用固定波長(zhǎng)得不到較好的分離度，因此，按物質(zhì)出峰順序設(shè)定不同的檢測(cè)波長(zhǎng)段，且基線平穩(wěn)，出峰穩(wěn)定，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)：0～20 min，320 nm；20～30 min，230 nm；30～40 min，320 nm；40～60 min，280 nm。

流動(dòng)相的選擇：比較甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%醋酸水，乙腈-0.1%三氟乙酸水，乙腈-0.1%三乙胺，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.5%磷酸水，乙腈-1%磷酸水8種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫時(shí)基線平穩(wěn)，出峰時(shí)分離度和峰形較好，因此將其作為流動(dòng)相。

流速的選擇：比較1、0.8、1.5 mL/min 3種流速，發(fā)現(xiàn)1 mL/min流速下峰形最好，故選用1 mL/min。

柱溫的選擇:比較25、30、35 ℃下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在35 ℃時(shí)色譜圖出峰最多且分離度和峰形都較好，故選擇35 ℃。

色譜條件確立：根據(jù)上述試驗(yàn)，色譜柱：Agilent Eliplse C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈A-水B(含0.1%磷酸)，梯度洗脫；流速1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～20 min，320 nm；20～30 min，230 nm；30～40 min，320 nm；40～60 min，280 nm；柱溫35 ℃；梯度變化見表1。

表1 流動(dòng)相梯度(%)

2.2.3 方法學(xué)考察 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗(yàn)：在上述色譜條件下，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按最高丹酚酸B計(jì)不得低于125 000。取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果表明，處方中的其他成分對(duì) 6種成分的測(cè)定無干擾。見圖2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取20 μL，依次注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度(μg/mL)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B分別在10.0～70.0 μg/mL、20～14 μg/mL、55～385 μg/mL、42～294 μg/mL、10.0～75.0 μg/mL、250～1 750 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。線性方程分別為：Y=54.508X+42.546，R2=0.999 1；Y=99.103X-122.86，R2=0.999 5；Y=14.376X+9.673 4，R2=0.999 8；Y=26.178X+49.756，R2=0.999 9；Y=131.01X+120.17，R2=0.999 8；Y=29.956X-623.61，R2=0.999 1。

圖2 乳腺增生丸HPLC色譜圖

重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)：取乳腺增生丸(批號(hào)：20130620)，平行制備6份供試液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量RSD分別為 1.26%、1.55%、2.54%、2.31%、1.25%、1.09%。

取混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次，綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的峰面積RSD分別為0.78%、0.95%、0.46%、0.68%、0.29%、0.56%。

取乳腺增生丸(批號(hào)：20130620)，取乳腺增生丸(批號(hào)：20120518)供試液，分別在0、4、8、16、24 h進(jìn)樣，測(cè)定6次，綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.85%、0.91%、2.56%、1.03%、0.99%、2.31%。

加樣回收率：取已知含量的同一批次乳腺增生丸6份(批號(hào)：20130620，綠原酸1.11 mg/g，咖啡酸1.26 mg/g，芍藥內(nèi)酯苷6.68 mg/g，芍藥苷3.04 mg/g，阿魏酸0.62 mg/g，丹酚酸B 4.29 mg/g)，每份約10 g精密稱定，分別精密加入6種對(duì)照品溶液適量，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下制成低、中、高3種濃度，每個(gè)濃度3份，按“2.2.4”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的平均回收率和RSD分別為100.5%、5.9%，100.2%、3.8%，101.2%、1.4%，99.9%、5.1%，100.6%、1.9%，99.8%、3.7%。

2.2.4 樣品含量測(cè)定 取5個(gè)批號(hào)乳腺增生丸樣品，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件依次進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，按照外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)法計(jì)算綠原酸、咖啡酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 TLC鑒別

3.1.1 供試品的溶劑量 由于本品為小蜜丸，含有50%的煉蜜，所以萃取液濃縮后很粘稠，加入1 mL溶劑不易點(diǎn)樣，所以加4 mL溶劑溶解，可降低其粘度，便于點(diǎn)樣。

3.1.2 提取方法和溶劑 分別用乙醇、甲醇、丙酮、氯仿采用超聲與回流方法提取，制成供試品后，在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開，結(jié)果丙酮和氯仿的薄層斑點(diǎn)邊緣不清，分離效果不好，乙醇和甲醇的薄層斑點(diǎn)相似，但鑒于甲醇的毒性比乙醇大，所以采用乙醇為提取溶劑。

3.1.3 展開劑 選用了氯仿-甲醇、甲醇-乙酸乙酯、苯-乙酸乙酯、甲苯-乙酸乙酯、苯-甲苯-乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)、正己烷-乙酸乙酯、環(huán)己烷-乙酸乙酯、環(huán)己烷-正己烷-乙酸乙酯的不同比例溶液作為展開劑，進(jìn)行薄層色譜試驗(yàn)，結(jié)果表明，在選用環(huán)己烷-正己烷-乙酸乙酯(4∶1∶2)時(shí)，樣品的薄層色譜分離好，斑點(diǎn)清晰，無干擾。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 陰性對(duì)照制備 因白芍中含有芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷[6]，丹參中含有丹酚酸B[7]，當(dāng)歸中含有阿魏酸[8]，蒲公英中含有綠原酸和咖啡酸[9]，所以陰性對(duì)照應(yīng)不含白芍、丹參、當(dāng)歸和蒲公英4味藥材。

3.2.2 定量指標(biāo)成分的選擇 本研究曾選擇處方中君藥柴胡有效成分柴胡皂苷a、d作為定量指標(biāo)成分，但經(jīng)過HPLC法測(cè)定數(shù)十批次的乳腺增生丸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很難測(cè)出柴胡皂苷a、d，因此不能作為定量指標(biāo)性成分。可能的原因：因柴胡皂苷a、d不穩(wěn)定，在制劑的生產(chǎn)和保存過程中，發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變或是化合物的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致不易檢測(cè)；其次可能測(cè)定方法的靈敏度低，可采用高靈敏度的儀器檢測(cè)(如HPLC-ELSD法)，這有待于今后進(jìn)一步的研究。

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