硼替佐米對大鼠腎移植AMR的保護作用及機制研究

黃耿文，丁 翔，雷 鵬

0 引言

抗體介導排斥反應(Antibody mediated rejection，AMR)是造成移植腎功能衰竭最主要的原因之一[1-2]。硼替佐米(Bortezomib)是蛋白酶抑制劑的代表性藥物。有報道顯示，硼替佐米可以抑制腎移植術后AMR的進程，緩解排斥反應所造成的移植腎功能損害，但其具體作用機制目前尚未闡明[3]。為此，筆者應用大鼠AMR腎移植模型，研究硼替佐米對腎移植AMR保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 AMR大鼠腎移植模型和實驗分組

1.1.1 移植前致敏 移植前3周預先取供體Brown-Norway大鼠全血0.5 mL，肝素化后經由受體Lewis大鼠陰莖靜脈一次性輸入，以此誘導受體產生供體特異性抗體(Donor specific antibody，DSA)。

1.1.2 移植 MHC完全不相容的供/受體大鼠(Brown-Norway/Lewis)間進行腎臟移植，一期移除受體雙側腎臟。具體手術方法：動脈吻合采用腹主動脈-腹主動脈端側吻合，靜脈吻合采用腎靜脈-下腔靜脈端側吻合，均用10-0 Nylon連續縫合；泌尿道重建采用輸尿管-輸尿管端端吻合，11-0 Nylon間斷縫合4～5針，不放內支撐。所有手術均由第一作者完成，手術成功率在90%以上。

1.1.3 實驗分組 分3組，每組6例。G1(假手術組)：受體大鼠僅做開腹關腹術；G2(AMR組)：按如上方法致敏和移植；G3(硼替佐米組)：按如上方法致敏和移植，移植手術前2 d起靜脈注射硼替佐米(0.03 mg/kg，2次/周)直至動物死亡或術后1周。

1.2 血清標本檢測 應用IDEXXVetTest化學分析儀檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平。血清DSA檢測采用流式細胞儀。具體方法：取供體大鼠脾臟，制成單細胞懸液，與受體血清孵育。然后分別與FITC耦合的山羊或小鼠抗大鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG2c的單克隆抗體冰上反應30 min，PBS洗凈，1%福爾馬林固定后流式細胞儀(Becton-Dickinson)檢測受體血清中DSA各亞型水平。

1.3 病理學檢查 所有石蠟切片經H&E染色后由病理科醫生按Banff標準單盲完成診斷和評分[4-5]。腎組織中C4d采用免疫組織化學法檢測。一抗為兔抗大鼠C4d多克隆抗體(Hycult Biotech)。C4d陰性記為0分，局灶性陽性表達記為1分，彌漫性陽性表達記為2分。移植腎組織中巨噬細胞采用免疫熒光法檢測。用小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體(AbDSerotec)標記巨噬細胞。按顯色細胞占細胞總數的比例分為弱(<30%)、中(30%～60%)和強陽性表達(>60%)。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行分析。定量資料多組間比較采用單因素方差分析，半定量等級資料比較采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 硼替佐米對腎移植大鼠腎功能的影響 術后1周硼替佐米組(G3)大鼠血清BUN和CRE分別為(33.17±0.15)和(0.75±0.04)mg/dL，而AMR組大鼠血清BUN和CRE分別為(48.33±0.17)和(1.30±0.05)mg/dL，假手術組則分別為(20.00±0.10)和(0.37±0.03)mg/dL，三組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組術后1周腎功能結果

2.2 硼替佐米對腎移植大鼠血清DSA的影響 見圖2。由圖2可見，術后1周硼替佐米組(G3)較之AMR組(G2)，血清IgM、IgG2b和IgG2c水平均顯著下降(P<0.05)。

圖2 硼替佐米對AMR腎移植大鼠血清DSA的影響

2.3 硼替佐米對腎移植大鼠腎臟病理損害的保護作用 見圖3。如圖3所示，AMR組(G2)大鼠移植腎臟呈現典型的急性AMR病理表現：腎小管周圍毛細血管和間質內單核巨噬細胞浸潤，腎小球內皮細胞塊狀缺失，腎小球內炎性細胞浸潤等。硼替佐米組(G3)大鼠移植腎上述AMR表現明顯減輕。

2.4 硼替佐米對腎移植大鼠腎臟C4d表達的影響 見圖4。由圖4可見，AMR組(G2)移植腎組織中腎小管周圍毛細血管(PTC)上C4d均呈彌漫性表達，而硼替佐米組(G3)腎組織PTC上C4d均呈局灶性表達，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 硼替佐米對移植腎巨噬細胞浸潤的影響 采用免疫熒光法標記腎臟組織中巨噬細胞(紅色)，可見硼替佐米組(G3)大鼠移植腎組織中巨噬細胞表達呈中等強度表達，明顯少于AMR組(G2)，AMR組均呈強陽性表達。見圖5。

圖3 兩組腎臟典型病理改變(×200)

圖4 兩組腎移植大鼠腎臟C4d表達(×200)

圖5 兩組移植腎組織中CD68表達(×200)

3 討論

AMR已成為目前臨床上移植腎失功的主要原因之一[6]。由于缺乏針對AMR有效的藥物，其較細胞排斥更難于治療，且后果更為嚴重。目前AMR的治療主要包括血漿交換和免疫吸附等方法，旨在迅速降低循環中既有的DSA水平。盡管如此，治療效果仍不盡理想。因此，開發有效針對AMR的藥物成為進一步提高腎移植患者術后長期存活的關鍵之一。

硼替佐米是一種強大的、可逆性的蛋白酶抑制劑，為FDA批準用于多發性骨髓瘤的治療[7]。硼替佐米可以抑制NF-κB誘導的存活信號，降低分化的漿細胞中蛋白酶的活性[8]。越來越多的資料顯示，硼替佐米用于臨床上治療頑固性AMR可以迅速降低血清DSA水平，改善移植腎功能，但是其具體機制目前并不清楚[3]。

本研究顯示，硼替佐米可以明顯抑制AMR大鼠血清中IgM、IgG2b和IgG2c等DSA亞型的水平，減少移植腎C4d的表達，顯著改善腎移植大鼠的腎臟功能，并且顯著減輕AMR大鼠移植腎的病理損害。表明硼替佐米具有抑制骨髓漿細胞產生DSA的能力，從而減輕DSA所誘導的補體激活及腎臟損害。最近的研究顯示，單核巨噬細胞是腎移植AMR發生發展過程中最主要的效應細胞，是導致移植腎損害最重要的攻擊細胞[9-12]。本研究顯示，硼替佐米還可以明顯減少移植腎組織中巨噬細胞的浸潤。由此證明，硼替佐米對AMR移植腎的保護作用與其抑制移植腎組織中巨噬細胞的浸潤有密切關系，其具體途徑有待進一步研究。

參考文獻：

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