化濁通脈散對ASO家兔ICAM-1指標表達的影響

李慎賢，吳 迪，程 磊，陳蘇寧，金鐘太，胡 瑩

0 引言

下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)是一種常見病、多發病，為退行性病變，是大、中動脈硬化的基本病理過程。主要是細胞纖維基質、脂質和組織碎片的異常沉積，在動脈內膜或中層發生增生的過程中的復雜病理變化。近年來，ASO發病呈現明顯的增高趨勢。研究表明，中醫藥在治療ASO方面有獨特優勢，體現了中醫的整體觀、因人制宜、組方靈活、副作用小的特點[1]。筆者觀察化濁通脈散對實驗性ASO家兔模型的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg，由我院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(遼)2009-0002。化濁通脈散組成：黃芪、金銀花、膽星、半夏、茯苓、白術、澤瀉、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭，由三九藥業集團提供，批號：0807021。通塞脈片，由江蘇南星藥業有限公司提供，批號：120509。西洛他唑片，由浙江大冢制藥有限公司提供，批號：120708T。膽固醇：由國藥集團化學試劑沈陽有限公司提供，批號：20120120。牛血清白蛋白注射液：由北京奧博星生物技術有限責任公司生產，批號：20120106。

主要試劑：Triozol Reagent，美國Invitrogen Life technologies公司；引物合成，北京華大基因公司；熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物。血脂系列試劑由我院生化室提供。

主要儀器：德國eppendorf5417R離心機，雅培ARCHITECTci8200全自動生化免疫分析儀，小型臺式離心機(美國SIGMA，1-13)，高速冷凍離心機 sigma 31k5C型，美國PCR擴增儀(德國Biometra)，紫外分光光度計(英國UV-visible Spectrometer，UV300)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物選擇及分組 選用健康純種新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg。實驗前適應性喂養1周，排除飲食異常者。1周后隨機分為5組，每組10只：正常組、模型組、化濁通脈散組、通塞脈片組、西洛他唑組。

1.2.2 造模 正常組喂養普通飼料，自由飲水。其余4組自實驗開始喂高脂飲食，每只每日在正常飼料中加膽固醇1 g、豬油5 g。第3天開始，均在10%烏拉坦麻醉下由左側股動脈插管，4F氣囊導管拖拉右側髂股動脈8次，造成機械性內膜損傷[2-3]。實驗第7天，模型組、實驗組、對照組經耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg造成免疫性內皮損傷；正常組注射等量生理鹽水。至20周末，動物模型出現室內放行時后腿拖拉或跛行，表示造模成功。

1.2.3 藥物治療 從21周開始至24周末，各組改為正常飲食，開始進行藥物干預。中藥治療組予化濁通脈散，按生藥7.2 g/(kg·d)，用量按70 kg成人用量3.3倍計算；中藥對照組予通塞脈片0.75片/(kg·d)，按60 kg體重成人每日用量20片計算；西藥對照組予西洛他唑片4.5 mg/(kg·d)，按60 kg體重成人的人兔體表換算公式計算，均混入飼料中喂養。

1.2.4 取材及實時熒光定量PCR檢測ICAM-1 mRNA相對表達量 取材：實驗結束后，將動物用乙醚麻醉，解剖切取股動脈血管多段，長約0.2～0.3 cm，放到盛有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中保存，制備實驗標本，然后處死動物。

液體配制：①DEPC水：吸出1 mL，放于1 000 mL雙蒸水中配成1‰ DEPC水，放于1 000 mL容量瓶中靜置4 h備用。②75%乙醇：無水乙醇+DEPC水，放于-20 ℃保存(DEPC水需先高壓)。

引物設計：目的基因RealTime PCR檢測引物，設計引物見表1。

表1 引物設計

操作步驟：參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA。采用紫外可見分光光度計測定260、280 nm的OD值，二者比值在1.8～2.0之間，逆轉錄合成cDNA。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。應用ABI 7500 擴增儀進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 0.5 min，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1個循環。通過測定熒光強度而對PCR產物定量。

2 結果

根據RT-PCR原始檢測結果，儀器可自動按設定的分析方法計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于正常組目的基因mRNA轉錄水平的差異-2-△△ct值，見表2。各組中ICAM-1的mRNA相對表達量見圖1。由圖1可見，B、C、D、E組的ICAM-1 mRNA表達水平高于A組(P<0.01)，C、D、E組的ICAM-1 mRNA表達水平低于B組(P<0.01)，D、E組的ICAM mRNA表達水平高于C組(P<0.01)。ICAM-1、GAPDH的擴增曲線和溶解曲線見圖1。結果表明，PCR的擴增效率及產物特異性均高，排除了非特異性產物的干擾。

表2 各組對ICAM-1 mRNA表達的影響

圖1 ICAM-1 mRNA的相對表達量

3 討論

下肢動脈硬化閉塞癥屬中醫“脈痹”、“脫疽”[4]、“血癖”范疇，在古典文獻中多有記載。中醫學認為，本病與飲食失節、臟腑虧虛、經脈痹阻等有密切關系[5]。飲食失節，膏粱厚味，損傷脾胃，濕濁內生，痰癖互結，阻塞經脈；或因氣血虧虛，運行無力，脈絡癖阻，氣虛血癖，經脈痹阻，氣血不達四末而發為“脈痹”。或因肝腎虧虛，氣竭精傷，腎水消灼，筋練骨枯，而成“脫疽”之癥。氣血淤滯不通、肢體失榮是其標，脾失健運、痰濕脂濁壅積、阻滯經脈是其本。本研究遵循“治病務求其本”的原則，以化痰健脾、益氣通脈為治療方法，組成化濁通脈散(黃芪、川芎、水蛭、金銀花、膽南星、半夏、茯苓、白術、澤瀉、焦山楂、延胡索)。此方從中醫角度加強了古方的活血化瘀、化濁通脈作用，從西醫方面加強了古方抗凝血、抗血栓形成、降脂及抑制血管內壁動脈硬化斑塊形成的作用。重用黃芪：補氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。川芎、水蛭：活血祛瘀，為臣藥。膽南星、半夏：祛痰泄濁通絡；澤瀉：利水滲濕；焦山楂：消痰化瘀；金銀花：清熱解毒；延胡索：行氣止痛，行血中之氣，又能行氣中之血。以上共為佐藥。全方共同組成益氣化瘀通絡、健脾祛痰化濁之功。

研究表明，黃芪能抑制血小板粘附，消除自由基，減少過氧化脂質，穩定細胞膜，增強機體非特異性免疫功能[6-9]。金銀花具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗血小板聚集、降低膽固醇、抗氧化等作用[10]。白術能增強機體清除自由基的能力，具有明顯的抗氧化作用。川芎對血管內皮細胞有保護作用，對血管平滑肌細胞增殖有抑制作用，可改善血液循環，調節血脂。半夏有降壓作用。茯苓可抗氧化、抗炎、提高免疫力[11]。澤瀉具有降低血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗血栓形成及增強纖溶酶活性等作用，能從降低血脂、抑制內皮細胞損傷、抗血栓等多個方面抑制或減輕動脈粥樣硬化的發生、發展[12]。水蛭具有抗凝、抗血栓、保護內皮細胞及抗炎的作用，研究表明，水蛭中的水蛭素是迄今發現的最強的凝血酶特異性抑制劑[13]。膽南星可鎮痛，研究表明，5%膽南星水溶液的鎮痛率為90.91%[14]。焦山楂有降血脂的作用[15]。延胡索中的生物堿具有很強的鎮痛、降壓的作用，四氫黃連堿對二磷酸腺苷、花生四烯酸和膠原誘導的兔血小板聚集均有抑制作用[16]。以上藥理學研究表明，此方從降低血脂、抗氧化消除自由基、抗凝血、抗血栓形成、抗炎、增強纖溶酶活性、保護血管內皮等方面發揮作用，可改善下肢血液循環，抑制血管內壁動脈硬化斑塊的形成。本研究結果表明，化濁通脈散可以起到防治ASO的目的。

研究認為，高脂血癥是下肢動脈硬化閉塞癥的一種危險因素[17]，本研究亦證實了此觀點。TC、TG、LDL過高都是下肢動脈硬化閉塞癥的危險因子。LDL是致動脈粥樣硬化的基本因素，其通過血管內皮進入血管壁內，在內皮下滯留的LDL被修飾成氧化型LDL(ox-LDL)，ox-LDL不能被正常LDL受體識別，而被巨噬細胞的清道夫受體識別而快速攝取，巨噬細胞吞噬ox-LDL后形成泡沫細胞，后者不斷地增多、融合，構成了動脈粥樣硬化斑塊的脂質核心。ox-LDL可刺激機體產生大量的黏附分子、化學趨化分子、細胞因子、生長因子和細胞毒素等，進一步促進了動脈粥樣硬化的發生、發展[18]。而HDL能移除外周組織的膽固醇，轉運給肝臟進行分解代謝。也有研究提示，HDL還可能通過抗炎、抗氧化和保護血管內皮功能而發揮其抗動脈粥樣硬化作用，具有防治動脈粥樣硬化發生、發展的作用。研究表明，化濁通脈散雖對HDL作用不明顯，但對TG、LDL有較明顯的抑制作用，亦減輕了以上LDL促動脈粥樣硬化的作用，說明化濁通脈散可通過減低血脂來抑制動脈粥樣硬化形成和發展。

現代醫學認為，動脈硬化病變是從受累動脈的內膜開始，近年來多數學者支持內膜損傷炎癥反應學說，認為完整的內皮細胞是動脈的生理屏障，基于其擴血管、抗凝、抗血小板、抗脂質沉積和抗縮血管物質的綜合作用，才能夠保證血液的正常流動，防止血栓和AS的形成。如果內皮細胞遭受廣泛和嚴重的損害，就會出現與之相反的病理生理變化。ICAM-1是免疫球蛋白超家族的成員，在中性粒細胞遷移和內皮細胞粘附導致動脈硬化過程中起重要作用[19]。正常內皮細胞中ICAM-1表達很低，炎癥反應開始時，多種炎性介質及細胞因子刺激內皮細胞，使ICAM-1等表達增加[20-22]，白細胞通過內皮細胞跨膜游出，趨向炎癥灶，大量單核細胞粘附于損傷內皮表面，并跨過內皮層進入內皮下基質，吞噬大量脂質，變為激活的巨噬細胞，最后成為泡沫細胞[23]。ICAM-1還介導淋巴細胞聚集在損害部位，導致斑塊內炎細胞浸潤增加，通過分泌各種水解酶導致斑塊不穩定[24]。在動脈硬化斑塊的發生、發展中起關鍵作用。ICAM-1是ASO早期的病理變化的促進因素，并與其嚴重程度有關[25]。

綜上所述，化濁通脈散可有效降低ICAM-1在血管內皮細胞上的表達，因此可有效防治動脈硬化斑塊的形成與發展。

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