阿霉素誘導(dǎo)小鼠局灶節(jié)段性腎小球硬化腎病模型的研究

劉 娜，王艷秋，杜 豐，邊曉慧，孫廣萍，張蓓茹，周光宇

0 引言

局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是腎病綜合征的常見病理類型，但其發(fā)病機(jī)制及發(fā)生、發(fā)展過程尚不清楚。局灶節(jié)段性腎小球硬化動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯繛槿祟怓SGS的認(rèn)識提供了線索和依據(jù)。阿霉素腎病模型是國內(nèi)外公認(rèn)的能較好模擬人類微小病變及局灶節(jié)段性腎小球硬化腎病綜合征的動物模型[1-2]。該模型通過鼠尾靜脈注射阿霉素(多柔比星)而誘發(fā)，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥等。阿霉素誘導(dǎo)的大鼠模型于20世紀(jì)80年代初就有大量國外及國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道,現(xiàn)已經(jīng)較為成熟。阿霉素誘導(dǎo)的小鼠模型國外自上世紀(jì)90年代開始研究,而國內(nèi)近年才有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]。我們通過給BALB/c小鼠尾靜脈注射10 mg/kg阿霉素誘導(dǎo)該模型，并動態(tài)觀察阿霉素注射后1、2、4、6周尿蛋白、血生化及光鏡、電鏡下腎組織病理改變以進(jìn)一步證實(shí)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物:SPF級雄性BALB/c小鼠50只，體重(20±2)g，4～ 6周齡。購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室,批號：SCSK(京)2009-0004。在我院動物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。試劑:阿霉素針劑(鹽酸多柔比星)，10 mg/瓶，美國輝瑞制藥有限公司，進(jìn)口藥品注冊證號：H20100406。儀器：美國雅培公司IC16000型全自動生化分析儀；顯微鏡(OLYMPUS),日本電子公司JEOL JEM-1200EX型電子顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物模型建立 實(shí)驗(yàn)組(40只):小鼠尾靜脈一次性注入阿霉素10 mg/kg(阿霉素按1 mg/mL溶于生理鹽水中，即10 mL/kg);對照組(10只):鼠尾靜脈一次注射生理鹽水10 mL/kg。兩組均以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng),自由攝食及飲水。

2.2 標(biāo)本收集 兩組均于注射阿霉素前1 d、注射阿霉素第1、2、4及6周用代謝籠收集24 h尿液，測尿量，3 000 r/min離心5 min，去除沉渣，-20 ℃冰箱保存待測；對照組于第6周，實(shí)驗(yàn)組于收集尿液結(jié)束當(dāng)天各取大鼠6只,4%水合氯醛麻醉,下腔靜脈采血，置入試管，室溫下2 h內(nèi)離心，3 000 r/min 15 min，取血清，-20 ℃冰箱保存待測；剖腹取雙腎,分別稱重，左側(cè)腎剖開,用4%多聚甲醛固定,用于普通光鏡檢查；右側(cè)腎取腎上極和下極，于上極處取1 mm3大小腎組織2塊，置于2.5%戊二醛中固定，待透射電鏡檢查，剩余部分用4%多聚甲醛固定,用于普通光鏡檢查。

2.3 檢測指標(biāo) 尿蛋白定量，血清白蛋白(ALB)、膽固醇(Chol)、三酰甘油(TG)及尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)；腎組織光鏡及電鏡檢測。采用柳氮磺酸比濁法檢測尿蛋白定量。用美國雅培公司IC16000型全自動生化分析儀檢測ALB、Chol、TG及BUN、Gr。

2.4 病理學(xué)方法

2.4.1 腎臟組織切片 腎臟標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，75%～100%乙醇逐步脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片(厚度2 μm)，烤片備用。

2.4.2 HE染色 石蠟切片→二甲苯1(20 min)→二甲苯2(30 min)→100%乙醇5 min→95%乙醇1 min→85%乙醇1 min→放入自來水中(以上步驟簡稱脫蠟至水)→蘇木素染色10 min→洗凈→流水還原15 min→伊紅染色半min→流水洗凈→95%乙醇1(l min)→95%乙醇2(l min)→100%乙醇1(10 min)→100%乙醇2(10 min)→二甲苯1(10 min)→二甲苯2(10 min)→中性樹膠封片。

2.4.3 Masson染色 石蠟切片脫蠟至水→Masson復(fù)合染色液5 min→蒸餾水沖洗→磷鉬酸5 min→甩干→苯胺藍(lán)5 min→蒸餾水稍沖→分化液30～60 s→乙醇脫水，二甲苯透明→封片。

2.4.4 PAS染色 石蠟切片脫蠟至水→高碘酸10 min→水洗2 min→滴加Schiff試劑10～20 min→偏重硫酸鈉溶液1 min×2→水洗10 min→蘇木素染色5 min→流水沖洗→乙醇脫水，二甲苯透明→封片。

2.4.5 電鏡 取2.5%戊二醛固定的腎組織塊→0.1 MPBS漂洗→1%鋨酸固定→0.1 MPBS漂洗→30%～100%乙醇脫水→EPON812浸透包埋→超薄切片70 nm→醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色→電鏡下觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)組40只小鼠于阿霉素注射后第1周均出現(xiàn)精神不振，毛質(zhì)粗糙及脫毛，活動量減少，進(jìn)食差，有不同程度的腹瀉及體重減輕，由表1可見,小鼠注射阿霉素后,其平均體重迅速下降,第2周降至最低，然后逐漸回升,但與正常組相比仍有顯著差異(見表1、圖1a)。阿霉素腎病早期腎臟肥大,后期逐漸變小,可以用腎重/體重來表示(見圖1b);實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)組4只小鼠因腹瀉及消瘦死亡；1只出現(xiàn)消化道出血并死亡；4只出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚破潰，其中2只死亡；共死亡7只，死亡率為17.5%。3只復(fù)制模型失敗，被剔除。對照組小鼠健康存活。

3.2 尿蛋白及生化指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組尿蛋白與對照組相比，第1、2、4、6周顯著增加(P均<0.01);對照組各周尿蛋白比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組尿蛋白從第1周開始增加，與0周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),隨時(shí)間延長逐漸增多,第2周達(dá)高峰,4、6周與2周相比,尿蛋白稍有下降,但與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1、圖1c)。

表1 兩組小鼠體重、尿蛋白比較

圖1 兩組小鼠體重、體重/腎重、尿蛋白及血清白蛋白變化趨勢

實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，ALB于第1周開始下降(P<0.01),2周達(dá)最低值,4、6周較2周稍升高,但仍處低水平狀態(tài),與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖1d;TG、Chol于第1周開始升高(P<0.01),第2周達(dá)高峰,第4、6周較第1、2周下降，但仍處于高水平狀態(tài)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);BUN于1周開始升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),2周達(dá)高峰,4、6周與1、2周相比稍有下降，但仍處于高水平狀態(tài)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Cr無顯著性升高。見表2。

表2 兩組血生化指標(biāo)比較(n=6)

3.3 光鏡 實(shí)驗(yàn)組第1周腎小球無明顯變化，腎小管可見蛋白管型;第2周部分腎小球可見節(jié)段性硬化，腎小管蛋白管型增多，較易見到；第4周、6周可見50%以上腎小球中出現(xiàn)節(jié)段性硬化，腎小管擴(kuò)張明顯,可見大量蛋白管型及局部間質(zhì)纖維化；對照組腎小球及腎小管無變化(見圖2)。

圖2 光鏡下腎組織病理改變(HE×400)

3.4 電鏡 對照組足突清晰完整，未見融合，實(shí)驗(yàn)組于第1周偶可見足突融合,第2周足突融合更廣泛,第4、6周出現(xiàn)足突細(xì)胞融合變形[3],體積變大,胞質(zhì)中微絲增多,并出現(xiàn)囊泡及包涵體，毛細(xì)血管袢閉塞,充血,大量紅細(xì)胞填塞,內(nèi)皮細(xì)胞孔消失,基底膜正常(見圖3)；于第2周近端小管出現(xiàn)微絨毛排列紊亂,胞質(zhì)局灶性溶解,線粒體正常,遠(yuǎn)端小管微絨毛亦減少，基底膜局部有溶解、斷裂。

圖3 電鏡下腎組織病理改變(×6 000)

4 討論

蛋白尿?yàn)槟I小球疾病最常見的臨床表現(xiàn)，近年研究認(rèn)為，足細(xì)胞損傷既是蛋白尿產(chǎn)生的原因，也是各種腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，單純足細(xì)胞損傷即可引發(fā)進(jìn)行性腎小球硬化。阿霉素及其代謝產(chǎn)物可能從DNA水平直接干預(yù)足突細(xì)胞的蛋白合成，使足突細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂,造成足突細(xì)人類的微小病變及局灶節(jié)段性腎小球硬化腎病極其相似[5-6]。用BALB/c小鼠建立此模型的優(yōu)點(diǎn)包括:BALB/c小鼠對阿霉素易感，劑量范圍控制在9.8～10.4 mg/kg就能夠迅速出現(xiàn)蛋白尿和腎小球硬化，而且與人類的局灶節(jié)段性腎小球硬化發(fā)展過程極其相似[7]；小鼠經(jīng)濟(jì)方便,單次鼠尾靜脈注射阿霉素誘導(dǎo)腎病模型，方法簡便易行，藥物用量少，更易操作,加之進(jìn)口阿霉素(多柔比星)較國產(chǎn)產(chǎn)品對心臟、肝臟、骨髓、胃腸等系統(tǒng)的毒副作用相對較小，因此大大降低了小鼠的死亡率，而且該模型鼠間差異小，重復(fù)性和穩(wěn)定性好,可用于大量實(shí)驗(yàn)研究。我們采用BALB/c小鼠單次鼠尾靜脈注射10 mg/kg阿霉素復(fù)制FSGS模型，結(jié)果顯示，小鼠在阿霉素注射后第1周均開始出現(xiàn)不同程度的腹瀉，有4只小鼠因腹瀉及消瘦死亡；1只出現(xiàn)消化道出血并死亡；3只出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚破潰，其中2只死亡；共死亡7只，死亡率為17.5%，低于文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。

本研究實(shí)驗(yàn)組尿蛋白從第1周開始增加,2周呈現(xiàn)典型的腎病綜合征改變，即大量蛋白尿，低蛋白血癥和高脂血癥，第4、6周不如第2周改變明顯，但與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光鏡下，實(shí)驗(yàn)組第1周腎小球無明顯變化，腎小管可見蛋白管型；第2周部分腎小球可見節(jié)段性硬化，腎小管蛋白管型增多，較易見到；第4、6周可見50%以上腎小球中出現(xiàn)節(jié)段性硬化，腎小管擴(kuò)張明顯,可見大量蛋白管型及局部間質(zhì)纖維化。這一結(jié)果提示BALB/c小鼠單次尾靜脈注射10 mg/kg阿霉素復(fù)制阿霉素腎病模型成功。

電鏡檢測結(jié)果，主要呈現(xiàn)腎小球足細(xì)胞異常，即正常的腎小球足細(xì)胞足突消失，足突融合，呈現(xiàn)扁平足突細(xì)胞,這一改變在第1周較輕,僅見灶性融合，第2周足突融合更廣泛,第4、6周出現(xiàn)足突細(xì)胞變形,體積變大,胞質(zhì)中微絲增多,并出現(xiàn)囊泡及包涵體。說明隨著阿霉素注射后觀察時(shí)間延長，病變也逐漸加重。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)模型復(fù)制成功。足突細(xì)胞的這種超微結(jié)構(gòu)改變早于尿蛋白的發(fā)生，其嚴(yán)重程度與尿蛋白排出量相一致，提示足突細(xì)胞的這種超微結(jié)構(gòu)改變與阿霉素腎病尿蛋白的發(fā)生有關(guān)。總之，本研究進(jìn)一步證實(shí)單次BALB/c小鼠鼠尾靜脈注射10 mg/kg阿霉素，可成功誘導(dǎo)局灶節(jié)段性腎小球硬化模型，為未來研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Whiteside C,Prutis K,Cameron R,et al.Glomerular epithelial detachment,not reduced charge density,correlates with proteinuria in adriamycin and puromycin nephrosis[J].Lab Invest,1989,61(6):650-660.

[2] 郭繼光，白楊，周廣濱.阿霉素腎病動物模型的研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,24(2):181-184.

[3] De Mik SM,Hoogduijn MJ,de Bruin RW,et al.Pathophysiology and treatment of focal segmental glomerulosclerosis:the role of animal models[J].BMC Nephrol,2013,14:74-84.

[4] 王曉麗，崔晶晶，楊海平，等.全反式維甲酸對阿霉素腎病小鼠腎臟保護(hù)作用研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012，484-488.

[5] Haidle CW,McKinney SH.Adriamycin-mediated introduction of a limited number of single-strand breaks into supercoiled DNA[J].Cancer Biochem Biophys,1986,8(4):327-335.

[6] Diamond JR,Anderson S.Irreversible tubulointerstitial damage associated with chronic aminonucleoside nephrosis[J].Am J Pathol,1990,137:1323-1332.

[7] Cao Q,Wang Y,Zheng ,et al.IL-10/TGF-beta-modified macrophages induce regulatory T cells and protect against adriamycin nephrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21:933-942.

[8] Wang Y,Wang YP,Tay YC,et al.Progressive adriamycin nephropathy in mice:Sequence of histologic and immunohistochemical events[J].Kidney Int,2000,58:1797-1804.

[9] Lee VW,Harris DCH.Adriamycin nephropathy:A model of focal segmental Glomerulosclerosis[J].Nephrology,2011,16:30-38.