亮菌甲素注射液與不同溶媒的配伍穩(wěn)定性考察

潘丹婷，林淑瑜，李玉堂，甘惠貞

0 引言

亮菌甲素是一種香豆素類化合物，系從假密環(huán)菌中提取的有效成分之一。亮菌甲素具有降酶、退黃的作用，臨床上主要用于急、慢性膽囊炎發(fā)作、其他膽道疾病并發(fā)急性感染及慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎的治療，是一種優(yōu)良的肝膽用藥[1-2]。亮菌甲素由亮菌(環(huán)菌屬假密環(huán)菌)中提取，能促進(jìn)肝細(xì)胞分泌膽汁，松弛奧狄括約肌，調(diào)節(jié)膽道系統(tǒng)，促進(jìn)膽道內(nèi)容物排泄，從而減輕膽汁淤積，同時(shí)能促進(jìn)免疫功能，增強(qiáng)吞噬功能，改善肝細(xì)胞水腫和肝纖維組織增生，促進(jìn)受損的肝細(xì)胞修復(fù)和再生，進(jìn)一步改善肝功能。亮菌甲素可縮短肝炎病程及黃疸持續(xù)時(shí)間，從而提高臨床療效。亮菌甲素藥物說明書“不良反應(yīng)”一欄上無嚴(yán)重不良反應(yīng)，但有文獻(xiàn)報(bào)道該藥物在臨床使用中仍可發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)[3]。

亮菌甲素在水中幾乎不溶，為滿足臨床用藥需求，常需加聚維酮K30、丙二醇、苯甲醇等增溶劑以提高其在水中的溶解度[4]。這些增溶劑是否會(huì)影響該藥物在不同溶媒介質(zhì)中的穩(wěn)定性，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。我們?cè)谂湟哼^程中觀察到，亮菌甲素與5%葡萄糖注射液配伍時(shí)，溶液呈無色澄清液體，與0.9%氯化鈉注射液配伍時(shí)，溶液呈藍(lán)熒光黃色液體，不同溶媒藥物的熒光強(qiáng)度不同。因此本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定亮菌甲素的含量，以考察亮菌甲素與6種注射液的配伍穩(wěn)定性及其熒光強(qiáng)度隨溶劑pH值的變化情況。

1 儀器和試藥

Ultimate3000高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)；JA2003電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海誠寧環(huán)保科技有限公司)；注射器；移液槍；亮菌甲素注射液(西安利君制藥有限責(zé)任公司，規(guī)格：2 mL∶1 mg，批號(hào)：120502)；亮菌甲素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：MUST-11301403)；0.9%氯化鈉注射液(四川沱牌藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：250 mL∶2.25 g，批號(hào)：B1210104)；5%葡萄糖注射液(四川沱牌藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：250 mL∶12.5 g，批號(hào)：B1207301)；10%葡萄糖注射液(四川沱牌藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：250 mL∶25 g，批號(hào)：B1208113)；葡萄糖氯化鈉注射液(四川沱牌藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：250 mL∶葡萄糖2.25 g，氯化鈉12.5 g，批號(hào)：B1112252)；木糖醇注射液(河南天方華中藥業(yè)有限公司，規(guī)格：250 mL∶12.5 g，批號(hào)：F12050501)；乳酸鈉林格注射液(四川沱牌藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：500 mL，批號(hào)：B1210133)；甲醇(美國進(jìn)口Fisher色譜純)、冰醋酸(美國進(jìn)口MREDA色譜純)；水為超純化水(本院消毒供應(yīng)室提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Acclaim C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1 mol/L冰醋酸-甲醇(50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：368 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備 (1)對(duì)照品溶液的制備：精密量取亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制得0.5 mg/mL的亮菌甲素對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光、室溫下保存。(2)供試品溶液的制備：模擬臨床應(yīng)用方法實(shí)際常用量配制，分別取亮菌甲素注射液各5 mg 加入250 mL的0.9%氯化鈉、5%葡萄糖、10%葡萄糖、葡萄糖氯化鈉、木糖醇、乳酸鈉林格注射液中，避光、室溫下保存。

2.3 線性關(guān)系的考察 精密量取上述亮菌甲素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.6 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度。再分別精密吸取一定量，稀釋制成濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL的溶液。在色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL。以濃度(X,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.995 3 X + 0.256 2，r2=0.999 9，結(jié)果表明，亮菌甲素在5.0～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系(見圖1)。

圖1 亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn) 制備高、中、低3種不同濃度的亮菌甲素對(duì)照品溶液(20、40、80 μg/mL)各5份，同日測定并連續(xù)測定5 d，計(jì)算峰面積，得高、中、低濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為0.01%、0.05%、0.06%；日間精密度RSD分別為1.33%、1.62%、1.82%，結(jié)果表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按照對(duì)照品溶液制備方法制備20 μg/mL亮菌甲素對(duì)照品溶液6份，進(jìn)樣，測得峰面積RSD=0.34%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量、不同體積(300、500、1 000 μL)的供試品溶液各3份，分別精密加入500 μL的對(duì)照品溶液(20 μg/mL)，取20 μL進(jìn)樣。結(jié)果亮菌甲素的加樣回收率為103.45%～ 104.31%(見表1)。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(μg)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試液，分別于0、1、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣分析，根據(jù)亮菌甲素的峰面積計(jì)算，得RSD為0.62%(n=7)，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.8 供試品含量測定 分別取不同溶媒的供試液，在0、1、2、4、6、8、24 h分別測定，記錄色譜峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算得亮菌甲素的含量。以(0 h)含量為100.00%，換算百分含量(見表2)并觀察配伍液的pH值、顏色、澄清度(見表3)，結(jié)果表明配伍穩(wěn)定性良好。

表2 亮菌甲素配伍穩(wěn)定性測定結(jié)果(%)

表3 配伍液在室溫條件下的物理相容性變化

圖2 色譜圖

2.9 不同pH條件下熒光強(qiáng)度考察試驗(yàn) 分別配置pH值為2.0～8.0的不同梯度的磷酸鹽緩沖溶液并各取10 mL于不同的比色管中，再分別加入200 μL亮菌甲素注射液，觀察其溶液的熒光強(qiáng)度。pH為5.0～8.0時(shí)，呈藍(lán)色熒光黃色液體；pH為4.5～5.0時(shí)，肉眼觀察為微弱藍(lán)色熒光；pH為2.0～4.0時(shí)，肉眼觀察為無色透明液體，在紫外燈下可見微弱藍(lán)色熒光。

3 討論

3.1 亮菌甲素色譜條件的探索 本文分別考察了以 0.1 mol/L乙醇-甲醇(50∶50)[5]和0.1 mol/L冰醋酸-甲醇(50∶50)[6]為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在后者的條件下，亮菌甲素峰形對(duì)稱性增加，分離效果良好，即選擇0.1 mol/L冰醋酸-甲醇(50∶50)作為流動(dòng)相。對(duì)照品溶液于5.780 min有強(qiáng)吸收峰，供試品溶液于5.753 min強(qiáng)吸收峰(見圖2∶A-B)。由于亮菌甲素為香豆素類化合物，具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，溶液的酸堿性對(duì)其存在形式有明顯影響，堿性條件下，易使亮菌甲素開環(huán)[4]。因此，為使亮菌甲素均以內(nèi)酯形式存在，樣品溶液制備和流動(dòng)相中均采用0.1 mol/L冰醋酸溶液，所使用的色譜系統(tǒng)簡單，避免梯度洗脫帶來的不便，分析結(jié)果令人滿意。

3.2 亮菌甲素與常見的不同溶媒的配伍變化 本試驗(yàn)的目的是考察亮菌甲素與0.9%NS、5%GS、10%GS、GNS、木糖醇、乳酸林格液等6種注射液的配伍穩(wěn)定性，以及配伍液在室溫條件下的物理相容性變化(見表3)，為臨床用藥提供依據(jù)。因此，配伍液均按照臨床實(shí)際在室溫、不避光條件下配制。試驗(yàn)結(jié)果表明，該藥物分別與10%GS、GNS的配伍液在0 h肉眼觀察為無色透明澄清液體；分別與0.9%NS、木糖醇、乳酸林格的配伍液為藍(lán)色熒光澄清液體；與5%GS的配伍液為微弱藍(lán)色熒光澄清液，且該配伍液在1 h后肉眼觀察為藍(lán)色熒光澄清液體。由表2結(jié)果可得出，盡管不同配伍液熒光強(qiáng)度不同，在24 h內(nèi)亮菌甲素的含量基本不變，穩(wěn)定性均良好。

3.3 亮菌甲素的熒光強(qiáng)度隨溶劑pH值變化 當(dāng)溶液pH為5～8時(shí)，呈藍(lán)色熒光黃色液體；pH為4～5時(shí)，肉眼觀察微弱藍(lán)色熒光；pH為2～4時(shí)，肉眼觀察為無色透明液體，在紫外燈下可見微弱藍(lán)色熒光。香豆素衍生物在紫外光照射下呈現(xiàn)藍(lán)色或紫色熒光，在堿性溶液中熒光增強(qiáng)。熒光的強(qiáng)弱和有無，與結(jié)構(gòu)中的取代基種類和位置有關(guān)[7]。當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)其熒光強(qiáng)度有較大的影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，因此，熒光強(qiáng)度也有差異[8]。

4 結(jié)論

靜脈給藥是藥物直接進(jìn)入血液循環(huán)，除了對(duì)藥物的質(zhì)量有嚴(yán)格的要求外，對(duì)藥物進(jìn)入人體之前，即藥物貯存、配制溶媒、配制濃度、配伍藥物、特殊人群使用注意事項(xiàng)以及給藥速度等也都作了嚴(yán)格規(guī)定。亮菌甲素注射液是肝病科常用的退黃降酶藥，本品說明書上未說明“不良反應(yīng)”、“毒副作用”、“注意事項(xiàng)”，為控制和防范亮菌甲素注射液不良反應(yīng)的發(fā)生，建議用藥過程中，密切觀察病情變化，注意發(fā)現(xiàn)藥物不良反應(yīng)的早期癥狀，以便及時(shí)停藥和處理，防止進(jìn)一步發(fā)展[9]。本試驗(yàn)參考了配伍穩(wěn)定性的相關(guān)文章的研究[10]，用相關(guān)方法進(jìn)行了此試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法具有簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好，線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可作為亮菌甲素的含量測定。測定結(jié)果顯示，亮菌甲素在不同pH的溶媒中的熒光強(qiáng)度不同，熒光的強(qiáng)弱不影響藥物的穩(wěn)定性，該藥物與6種常見不同溶媒配伍24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，亮菌甲素隨pH值的增大，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。

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