螺內酯對心肌梗死后心肌細胞凋亡和增殖的影響

徐占穩，李亞芹，王乾一，王至尊，趙興洲

0 引言

廣泛心肌梗死導致的充血性心力衰竭及心室重構(Ventricular remodeling)，以心室擴大和心功能降低為特征。在缺氧、缺血再灌注等病理條件下，可以造成心肌細胞的凋亡。研究表明，急性心肌梗死后心肌細胞凋亡導致心肌細胞的持續性丟失，而且，細胞凋亡在心力衰竭的發生發展中起著重要作用。因此，改變細胞凋亡途徑可以減少心肌的損傷。以往對醛固酮經典的認識是促進鈉離子單向跨膜轉運，進而調節血容量和血壓。但近年來的臨床和實驗研究表明，心肌組織產生的醛固酮可能誘導了心肌細胞的凋亡，應用醛固酮拮抗劑如螺內酯、依普利酮，可以大大降低心力衰竭的發病率和死亡率[1-2]。

成年哺乳動物的心肌細胞具有增殖能力，心肌細胞增殖可作為心臟損傷后修復再生的基礎[3-4]。最近研究證明，螺內酯可以抑制新生大鼠心肌細胞的增殖[5]，而急性心肌梗死后螺內酯是否對心肌細胞增殖具有抑制作用尚未見相關報道。因此，本實驗運用醛固酮拮抗劑螺內酯進行干預，探討螺內酯對急性心肌梗死后心肌細胞凋亡和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠45只，體質量250～ 300 g，河北大學醫學部實驗動物中心。SD大鼠隨機分為3組：SHAM組、MI組和SPI組。模型制作：大鼠麻醉固定后，氣管插管，連接小型動物呼吸機。于左側第4肋間開胸，剪開心包暴露心臟，在左冠狀動脈前降支起始段下2～3 mm處用5～0絲線結扎。以結扎線下方心肌色澤變暗，室壁活動減弱為梗死模型成功。假手術組僅穿線繞過前降支根部而不結扎。繼續喂養到實驗終點(第7天)[6]。建立SHAM組大鼠模型14只，MI組13只，SPI組13只，SPI組術后即給予螺內酯灌胃,100 mg/(kg·d)[2]，SHAM組和MI組分別予等量生理鹽水灌胃。處死大鼠前再次麻醉開胸，于左心室心尖部用5/0無損傷線做一直徑約5 mm的荷包，中心部插入1.5 mm的帶針芯監測管至左心室，拔出針芯后監測管接轉換器于Maclab多功能生理儀，檢測左心室舒張末期壓(LVEDP)、收縮末期壓(LVESP)、收縮期左心室最大收縮上升速率(+dp/dtmax)和舒張期左心室最大下降速率(-dp/dtmax)，計算左心室壓(LVDP)，LVDP= LVESP-LVEDP。處死大鼠后，留取結扎線以下與房室溝平行的心肌組織，常規石蠟包埋，連續切片(4 μm厚)，粘片，烘烤。

1.2 原位細胞死亡檢測 羅氏凋亡檢測試劑盒,采用TUNEL法標記凋亡細胞，DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明及封片觀察。各標本在10×40倍光鏡下隨機采6～10個視野，應用計算機圖像計數和分析，以心肌凋亡陽性細胞數占心肌細胞數的百分比作為心肌細胞凋亡陽性率。

1.3 PCNA免疫組化染色 PCNA試劑(sc-9707)購自北京中杉金橋，1·100；SP免疫組織化學方法染色檢測,DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明及封片觀察。在10×40倍光鏡下采集標本圖像，每一標本隨機選取并采集6～10個視野，以細胞核染成棕褐色為PCNA表達陽性，進行計算機圖像分析和計算陽性率。

2 結果

2.1 大鼠心肌梗死后病理組織學變化(HE染色) HE染色光鏡下SHAM組心肌纖維排列整齊，橫紋、閏盤及細胞核染色清晰；MI組可見心肌水腫，心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂、溶解，胞漿染色不均勻，大量炎性細胞浸潤，部分心肌呈灶狀與片狀壞死；SPI組可見心肌水腫，部分心肌纖維斷裂，收縮帶形成，較多炎性細胞浸潤。

2.2 各組左心室功能比較 以LVDP及+dp/dtmax-dp/dtmax判斷左心室功能。MI組心功能較SHAM組明顯下降，SMI組較MI組顯著改善。見表1。

表1 各組LVDP和±dp/dtmax比較

2.3 TUNEL 凋亡陽性細胞核呈深棕色反應，胞漿不顯色。SHAM組幾乎無表達(圖1A)，MI組有大量表達(圖1B)，SPI組表達較少(圖1C)。MI組表達明顯高于SPI組(1.37%±0.08%vs 0.65%±0.05%，P<0.01，見表2)，提示螺內酯干預心肌梗死大鼠能明顯減少心肌細胞的凋亡。

圖1 TUNEL染色

2.4 PCNA PCNA顯色定位于心肌細胞核，呈棕色，胞漿不顯色。表達部位主要位于梗死周圍區域。SHAM組幾乎無表達(圖2A)，MI組(圖2B)與SPI組(圖2C)表達無明顯差異(0.53%±0.04%vs 0.50%±0.04%，P>0.05，見表2)。

圖2 PCNA免疫組化染色

表2各組凋亡指數、PCNA陽性率(%)

注：與SHAM組比較，*P<0.01；與MI組比較，#P<0.01

3 討論

在臨床中，醛固酮受體拮抗劑用于控制頑固性高血壓和有癥狀的心力衰竭。在一項大規模、長期試驗(RALES)中，使用小劑量醛固酮受體拮抗劑螺內酯(20 mg/d)治療當前或近期有心功能Ⅳ級癥狀的心力衰竭患者可以降低死亡和住院的危險，因而奠定了醛固酮受體拮抗劑在慢性心力衰竭治療中的地位。EPHESUS試驗表明，在血管緊張素轉換酶抑制劑和β受體阻滯劑治療基礎上，加用選擇性醛固酮受體拮抗劑，能夠使急性心肌梗死合并心力衰竭的患者進一步獲益，猝死的危險性和總死亡率下降。醛固酮受體拮抗劑在臨床中的獲益使其在心力衰竭尤其是急性心肌梗死后的心力衰竭中的應用越來越受到重視。

目前研究表明，多種心臟疾病的心力衰竭演變過程中，心肌細胞、膠原網架和血管床發生了一系列形態結構的改變，即心室重構。其中心肌細胞凋亡起著重要作用，抑制凋亡可延緩心力衰竭的發展[7]。與心肌梗死相關的心肌細胞凋亡與很多因素有關，包括嚴重的缺血、細胞能量水平、機械應力以及神經內分泌的激活[8]。有研究發現，在人類急性心肌梗死(AMI)晚期的尸解中，心肌細胞凋亡仍然非常活躍，而且遠離梗死區細胞凋亡指數(0．7%)遠遠低于梗死區(25.4%)，表明細胞凋亡主要存在于梗死區及梗死邊緣區。也有研究發現，早期MI患者遠離梗死區凋亡細胞數量仍然可觀。

心肌細胞凋亡與心室重構關系密切，抑制心肌細胞凋亡有利于改善心室功能。研究發現，急性心肌梗死后應用醛固酮拮抗劑螺內酯、依普利酮，可有效抑制左心室的擴張，降低室壁張力，改善心室重構，提高左室射血分數，減少舒張末期和收縮末期容量，從而減少心力衰竭患者的再住院率及住院時間[9-11]。其機制目前尚無統一認識，較早的研究認為，心力衰竭時腎素-血管緊張素系統激活，血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)表達增加，促進心肌纖維化。而醛固酮有獨立于ATⅡ和相加于ATⅡ的對心臟結構和功能的不良作用，醛固酮能夠刺激成纖維細胞轉變為膠原纖維，使膠原纖維增多，促進心肌間質纖維化，加重心室重構，從而促進心力衰竭的發展。心力衰竭患者短期應用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)，可降低血醛固酮水平，但長期應用，血醛固酮水平不能保持穩定，反而持續降低，即所謂“醛固酮逃逸現象”[12]。因此，心力衰竭患者在ACEI基礎上加用醛固酮受體拮抗劑，能進一步抑制醛固酮的有害作用，可望有更大的益處。

近年來的研究表明，醛固酮受體拮抗劑能夠抑制缺血心肌細胞凋亡，改善了心肌梗死后的心室重構，其可能存在鹽皮質激素依賴途徑和非依賴途徑。Mitsuo等[6]研究發現，螺內酯通過抑制鹽皮質激素受體和11β-羥類固醇脫氫酶2的表達，抑制心肌細胞凋亡進而改善心室重構。Thi等[12-13]發現螺內酯通過抑制抗凋亡蛋白ARC(Apoptosis repressor with caspase recruitment domain)的降解，調節細胞凋亡內源性途徑的活性，促進凋亡誘導蛋白Acinus和ICAD(Inhibitor of caspase-activated DNase)的降解。本研究發現，心肌細胞凋亡主要出現于中心壞死區域和存活心肌之間的低灌注區。MI組心肌細胞凋亡率明顯高于SPI組(1.37%±0.10%vs 0.65%± 0.06%，P<0.01)，MI組LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯低于SHAM組與SPI組，顯示螺內酯抑制了心肌細胞凋亡，改善了心肌梗死后的心功能。細胞凋亡的多少決定缺血損傷的輕重，提示我們可以從細胞凋亡的角度對缺血后心功能的恢復及心肌保護進行研究。

以往認為哺乳動物成熟的心肌細胞屬于終末分化細胞，因而成年心臟被看成終末分化器官，不存在心肌細胞增殖。然而近年來，一系列實驗結果驗證了在正常的或者由于缺血或非缺血而引起的急性或慢性心力衰竭的心臟中發現了固有心肌細胞的有絲分裂，證實存在心肌細胞增殖。心肌細胞增殖可作為心臟損傷后修復再生的基礎[4-5，14-15]。為了明確增殖心肌細胞的類型,很多實驗研究了心臟混合物分離過程中的心肌細胞特異性標記物和非心肌細胞的特異性標記物,以及增殖細胞的生物學標記，其中PCNA就是心肌細胞增殖的標記蛋白之一[16]。最近研究證明，螺內酯通過抑制心肌細胞增殖阻礙了新生大鼠心臟的發育，其機制可能是通過調節細胞分裂素活化蛋白激酶家族成員P38及P53的表達[5]。而急性心肌梗死后醛固酮拮抗劑是否對心肌細胞增殖具有抑制作用尚未見相關報道。我們應用PCNA定量心肌細胞增殖程度，結果表明，PCNA在SMI組和MI組之間表達無明顯差異。

因此，本實驗應用組織學方法初步驗證了螺內酯對于心肌梗死后心功能的保護主要是通過抑制心肌細胞凋亡而非心肌細胞的增殖，進一步闡釋了螺內酯對于心肌梗死后心室重構的影響，這對于螺內酯在改善心肌梗死后心室重構和心力衰竭的應用中又奠定了一定的理論基礎。

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