哮喘氣道重塑中smads蛋白變化及其對免疫的影響機制

婁春艷 綜述，李 敏 審校

(1.瀘州醫學院，四川 瀘州 646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院兒科，四川 成都 610072)

支氣管哮喘(哮喘)是呼吸道最常見的慢性疾病，其發病率及死亡率呈逐年上升趨勢［1］。哮喘患者的氣道重塑是長期炎癥刺激所導致組織損傷后不完全或過度修復所致，最終導致氣流不可逆性阻塞和氣道高反應，是哮喘反復發作的病理基礎，同時也是哮喘不能完全根治的最主要原因。免疫異常是哮喘發病的核心機制，T細胞的免疫失衡在哮喘發病中發揮著至關重要的作用。近年來隨著研究的深入，單純的Th1/Th2平衡理論已不能完全解釋哮喘的發病機制，由初始CD4+T細胞分化的Thl7細胞和CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Treg)之間的平衡，已成為哮喘發病機制研究的新熱點。TGF-β/smads信號通路是哮喘氣道重塑的主要調控途徑之一，它直接影響氣道壁膠原蛋白的沉積，促進纖維化的形成［2］。闡明smads蛋白家族對哮喘氣道重塑的影響將為我們進一步研究提供理論基礎。本文對smads蛋白家族對哮喘氣道重塑的影響、Th17/CD4+CD25+調節性T細胞與氣道重塑的關系、smads蛋白家族與哮喘氣道重塑中Th17/CD4+CD25+調節性T細胞變化的相互作用作一綜述。

1 smads蛋白家族的來源、生物學特性

smads蛋白家族是在脊柱動物、昆蟲和線蟲體內發現的轉錄因子家族，是迄今為止唯一一個被證實的TGF-β受體作用的底物。Raftery等［31］首先在果蠅體內發現可以補救dpp缺失突變的分子，命名Mad(mothers against dpp)，它是Dpp受體信號傳遞必需的下游效應分子。隨后savage等［4］通過對線蟲進行基因分析克隆出Mad相關基因sma-2、sma-3、sma-4，它們共同存在一個保守的結構域，是Mad同源物，可以形成復合物協同發揮作用，所以將Mad和sma蛋白及其類似物統一命名為 smad。根據smads蛋白家族結構和功能特點將其分為3類:①受體調節型Smads蛋白(receptor-regulated smads，R-smads)包括 smad1、smad2、smad3、smad5 和 smad8，研究［5］表明smads蛋白家族是細胞內重要的信號轉導蛋白，直接參與 TGF-β、骨形態發生蛋白(bone morphogeneticprotein，BMP)、活化素等的信號轉導，其中smad2和 smad3能被活化素、TGF-βI受體激活;而smad1、5和8能被BMP-I型受體磷酸化而激活;②通用調節 smads蛋白(common-mediator smads，smad4)smad4可以與被磷酸化后的R-smads形成異源性多聚體，這些復合物轉入細胞核內與DNA轉錄因子、不同的smad結合原件、轉錄共激活劑或者共抑制劑結合，正性或負性調控靶基因的表達［6］對于R-smads發揮功能是必不可少的;③抑制型smads蛋白(Anti-smads)，包括 smad6與 smad7，大多數靜息狀態的細胞中，Anti-smads主要存在于細胞核內，當外界因素作用時，其將從細胞核進入細胞內發揮作用比如TGF-β刺激、活化素和BMP信號等［7］，其中smad7作用較為廣泛，對R-smads均有抑制作用，而smad6對抑制BMP的信號更有特異性，故僅對smad1、5和8具有抑制作用。另外研究表明［8］smad7也可以在細胞核內直接發揮作用，從而抑制特定基因轉錄。

2 smads蛋白家族對哮喘氣道重塑的影響

哮喘的發病機制較為復雜，目前大多認為與免疫機制有關，涉及到多種細胞、炎癥介質及細胞因子，而氣道炎癥及氣道重塑是哮喘發生及反復發作的病理基礎。近年來人們把哮喘防治研究的重點放在延緩氣道重塑上，目前發現TGF-β/smad信號通路是導致哮喘氣道重塑發生的重要信號轉導機制之一。Smads蛋白家族是細胞內重要的TGF-β信號轉導和調節分子，是唯一比較明確的TGF-β信號轉導的下游信號蛋白，smads蛋白可逆的磷酸化作用在適當的TGF－β信號轉導中起關鍵作用［9］smads蛋白家族中 smad2、smad3、smad4、smad7 均參與 TGF-β信號轉導，在哮喘氣道重塑中發揮著重要作用。

2.1 R-smad與哮喘氣道重塑的發生 R-smad與哮喘氣道重塑的發生存在相關性，smad2、smad3可以促進纖維母細胞向纖維細胞分化，促進氣道肌成纖維細胞增殖。Lisa等［10］通過過表達 TGF-β、smad2可以增加氣道膠原蛋白沉積，平滑肌增生，明顯導致氣道平滑肌增厚，由此推測smad2與哮喘氣道重塑有關。Rosendahl應用雞卵清蛋白(ova)制備小鼠哮喘模型，應用免疫組化及RT-PCR方法檢測smad蛋白發現健康小鼠肺組織中幾乎無smad3蛋白的表達，而哮喘小鼠中smad3蛋白表達水平顯著上調。Park等［11］研究通過抑制 smad2、smad3的磷酸化，下調 TGF-β-Ⅰ型和Ⅱ型受體的表達，降低TGF-β誘導的報告基因的活性，可以抑制α-SMA、纖連蛋白、膠原纖維在人的纖維母細胞中表達，表明抑制Smad2、3的活性能抑制纖維母細胞分化，由此推測哮喘小鼠中smad3、smad2蛋白高表達與哮喘氣道肌成纖維細胞增殖相關。Dijke等［12］研究發現磷酸化后的smad2、smad3可以使內皮細胞表型向間質細胞表型轉化。Gregory等［13］研究發現smad3基因缺陷的小鼠經過敏原的長期刺激可見支氣管周圍肌成纖維細胞的數目減少、纖維化程度降低。國內孫祝美等［14］的研究通過RT-PCR及Westen Blotting測定慢性哮喘大鼠模型肺組織中 smad2mRNA、smad7mRNA表達和smads蛋白表達發現肺組織中smad2mRNA、smad2蛋白高表達，而 smad7mRNA、smad7蛋白低表達，由此推測在慢性哮喘發生中，R-smads蛋白有作用。但具體如何發揮作用的仍需進一步研究。

2.2 CO-Smads與哮喘氣道重塑 CO-Smads即smad4是整個TGF-β/smad信號轉導通路，一旦其表達異常將會影響TGF-β/smad的生物學功能，Smad4主要與磷酸化的R-smads蛋白形成異源性多聚體發揮作用。研究表明在哮喘大鼠氣道重塑模型中發現TGF-β1、smad3與smad4蛋白高表達與氣道重塑程度成正相關［15，16］。

2.3 Anti-Smad與哮喘氣道重塑 Anti-Smad包含smad6與smad7，其主要通過抑制活化的R-smad而發揮作用，smad7可以對TGF-β、活化素、BMP信號傳導均有抑制性，但smad6僅對BMP信號具有特異性，所以哮喘氣道重塑中主要是smad7通過阻斷TGF-β/smad信號轉導發揮作用。smad7可以與活化的TGF-β的Ⅰ型受體結合后阻止smad2與其結合和發生磷酸化，smad7主要表達與支氣管上皮細胞，Sagara等［17］發現哮喘患者支氣管上皮細胞中smad7蛋白表達較正常組低表達，且與哮喘氣道重塑程度呈負相關，體外實驗發現取消內源性smad7可以增強TGF-β的表達，而過表達smad7抑制TGF-β的表達，由此推測是否通過人為增加smad7蛋白表達就可以延緩或者減少氣道重塑的發生。

3 Th17/CD4+CD25+調節性T細胞與哮喘氣道重塑的關系

目前人們認為機體內Th17/CD4+CD25+調節性T細胞存在動態平衡，二者既存在密切相關聯系，在生物學功能及分化過程中又相互拮抗，TGF-β是調節分化的關鍵因子，單獨存在時使活化的CD4+T細胞向CD4+CD25+調節性T細胞分化，當與IL-6或者IL-23同時存在時趨向于向Th17分化，CD4+CD25+調節性T細胞還能通過自身分泌的TGF-β促進Th17細胞的發育。體外試驗研究表明［18］氣道局部的IL-17可以促進氣管結構細胞(支氣管纖維母細胞、上皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞及成纖維細胞)的活化，使這些細胞高度表達IL-6、IL-8和GCSF等細胞因子，進而促使中性粒細胞活化和趨化，加重氣道炎癥;此外，活化的中性粒細胞所產生的中性粒細胞彈性蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，能降解彈性蛋白并促進氣道腺細胞分泌，是影響氣道和肺組織結構的關鍵因素。Sagara等［17］、Bullens等［19］的研究均證實，中重度持續的哮喘患者中均可發現高水平IL-17AmRNA表達，中性粒細胞蛋白酶能夠增大支氣管內成纖維細胞介導的膠原纖維的收縮反應，由此推測IL-17間接參與了氣道重塑的發生。Kearley等［20］研究證實CD4+CD25+調節性T細胞細胞活性與哮喘發展相關，它可以通過IL-10減輕急性過敏性炎癥、氣道高反應及氣道重塑的發生。龐英等［21］應用OVA制備小鼠哮喘模型發現，哮喘小鼠脾單個核細胞中CD4+CD25+調節性T細胞百分率較正常小組顯著降低。黃花榮等［22］研究證實CD4+CD25+調節性T細胞與哮喘的嚴重程度具有相關性，哮喘患兒病情越嚴重，患兒外周血 CD4+CD25+調節性T細胞表達水平越低。由此推測哮喘患者體內Th17細胞數量及CD4+CD25+調節性T細胞數量表達異常與氣道炎癥和氣道重塑的發生相關，Th17/CD4+CD25+調節性T細胞平衡失調影響了哮喘患者疾病的嚴重程度。

4 氣道重塑中Smads蛋白家族對Th17/CD4+CD25+調節性T細胞的影響

在既往的研究中證實，smads蛋白家族、Th17/CD4+CD25+調節性T細胞之間的平衡紊亂在哮喘氣道重塑的發生發展中具有重要作用，而TGF-β/smad信號通路是導致哮喘氣道重塑發生的重要信號轉導機制之一。但目前研究對TGF-β/smads信號通路如何影響CD4+CD25+調節性T細胞和Th17細胞分化增殖的途徑尚不清楚。牟達等［23］表明在TGF-β誘導的CD4+CD25+調節性T細胞生成中FOXP3的表達與smad4的表達呈負相關。Tone等［24］最初認為FOXP3的第一增強子存在于smad3的作用位點，在iTreg分化的初期smad3就開始在此結合并促進foxp3的表達，當Smad3結合位點突變或者人們早期應用smad3的抑制劑就會導致CD4+CD25+調節性T細胞體外分化的完全消失，但隨后Takimoto等［25］的研究提示 smad2和 smad3在 CD4+CD25+調節性T細胞的分化中具有互補作用，當smad3缺失時，smad2可以承擔相應的作用而維持CD4+CD25+調節性T細胞的分化，只有smad2和smad3都缺失時，CD4+CD25+調節性T細胞的分化才會被完全抑制，由此推測smad2和smad3調控CD4+CD25+調節性T細胞的分化。Martinez等［26］研究表明 smad2在RORYt的協同作用下可以促進Th17細胞的生成，敲除smad2蛋白基因的小鼠體內Thl7細胞的反應降低，Smad2缺陷的小鼠體內T細胞分化成Thl7細胞的能力減少，由此推測smad2與Th17細胞的生成呈正相關。Fantini等［27］研究表明FOXP3可以通過下調smad7來增強TGF-β信號轉導通路，從而介導tregs的細胞發揮免疫抑制作用。當T細胞中缺乏smad7時可以延緩TH1細胞的應答反應及外周T細胞的增殖，但是對Th17細胞的應答反應卻無影響。由此推斷在哮喘氣道重塑中smads蛋白家族同樣影響了Th17及CD4+CD25+調節性T細胞細胞的分化和平衡調節，是我們今后進一步研究哮喘發病機制和降低疾病嚴重性的新的方向之一。

［1］ Gershon AS，Guan J，Wang C，et al.Describing and quantifying asthma comorbidity:a population study［J］.PLoS One，2012，7(5):e34967.

［2］ Ragini Vittal，Elizabeth AM，Amanda J.Fisher，Type V Collagen Induced Tolerance Suppresses Collagen Deposition，TGF-β and Associated Transcripts in Pulmonary Fibrosis［J］.PLoS One，2013，8(10):e76451.

［3］ Sekelsky JJ，Newfeld SJ，Reftery LA，et al.Genetic characterization and cloning of mothers against dpp，a gene required for decapent aplegic function in Drosophila me1anogaster［J］.Genetics，1995，139(3):1347-1358.

［4］ Savage C，Das P，Finelli AL，et al.Caenorhabditis elegans genes sma-2，sma-3，and sma-4 define a conserved family of transforming growth factor beta pathway components［J］.Proceedings of the National A-cademy of Sciences，1996，93(2):790-794.

［5］ Chen G，Deng C，Li YP.TGF-βand BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation［J］.International journal of biological sciences，2012，8(2):272-288.

［6］ Tao SJ，Sampath K.Alternative splicing of SMADs in differentiation and tissue homeostasis［J］.Dev Growth Differ，2010，52(4):335-342.

［7］ Takeshi I，Yusuke O，Atsuhiko H，et al.Regulation of TGF-b family signalling by ubiquitination and deubiquitination［J］.Biochem，2013，154(6):481-489.

［8］ Miyazono K，Maeda S，Imamura T，et al.BMP receptor signaling:transcriptional targets，regulation of signals，and signaling cross-talk［J］.Cytokine ﹠ Growth Factor Reviews，2005，16(3):251-263.

［9］ LIU T，Feng XH.Regulation of TGF-βsignaling by protein phosphateses［J］.Biochem J，2010，430(2):191-198.

［10］ Lisa GG，Sara AM，Simone AW，et al.Overexpression of Smad2 Drives House Dust Mite-mediated Airway Remodeling and Airway Hyperresponsiveness via Activin and IL-25［J］.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2010，182:143-154.

［11］ Park S，Ahn JY，Lim MJ，et al.IM-412 inhibits transforming growth factor β-induced fibroblast differentiation in human lung fibroblast cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，399(2):268-273.

［12］ Dijke PT，Egorova AD，Goumans MT，et al.TGF-beta Signaling in endothelial-to-Mesenchymal Transition:The Role of Shear Stress and Primary Cilia［J］.Sci Signal，2012，5(212):2.

［13］ Gregory LG，Mathie SA，Walker SA，et al.overex-pression of smad2 drives house dust mite-mediated airway remodeling and airway hyperresponsiveness via activin and IL-25［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，182:143-154.

［14］ Sun Z，Li F，Qian P，et al.Expressions of smads family protein in airway remodeling of chronic bronchial asthma rats and intervene effect of maqin decoction［J］.Jan，2012，19(1):15-17.

［15］ Kuang C，Xiao Y，Liu X，et al.In vivo disruption of TGF-βsignaling by Smad7 leads to premalignant ductal lesions in the pancreas［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(6):1858-1863.

［16］ 彭光耀，劉鑫，黃艷，等.TGF-β1/smads通路在哮喘氣道重塑模型中的動態變化，［J］.廣東醫學2010，31(5):557-560.

［17］ Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17［J］.Nat Immunol，2005，6(11):1133-1141.

［18］ Bllens DM，Truyen E，Coteur L，et al.IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients:linking T cell driven inflammation and granulocytic influx［J］.ReSpir Res，2006，7(3):135.

［19］ Sagara H，Okada T，Okumura K，et al.Activation of TGF-beta/Smad2 signaling is associated with airway remodeling in asthma［J］.the journal of Allergy Clinical immunology，2002，110(2):249-254.

［20］ Kearley J，Robinson DS，LIoyd CM.CD4+CD25+regulatory T cells reverse established allergic airway inflammation and prevent airway remodeling［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，122(3):617-624.

［21］ 龐英，李敏，張劍波，等.糖皮質激素對CD4+CD25+調節性T細胞和TLR4表達的影響［J］.實用醫院臨床雜志，2012，9(1):60-62.

［22］ 黃花榮，劉甜甜，麥賢弟，等.哮喘患兒外周血CD4+CD25+調節性T細胞的變化及其與哮喘病情的關系［J］.新醫學，2009，40:221-223.

［23］ 牟達，何芳.TGF-β與 MAPK細胞內信號轉導通路的交互調節及其在心血管疾病中的作用［J］.國際病理科學與臨床雜志，2006，26(2):130-134.

［24］ Tone Y，Furuuchi K，Kojima Y.Smad3 and NFAT cooperate to induce foxp3 expression through its enhancer［J］.Nat Immunol，2008，9(2):194-202.

［25］ Takimoto T，Wakabayashi Y，Sekiya T，et al.Smad2 and Smad3 are redundantly essential for the TGF-beta-mediated regulation of regulatory T plasticity and Thl development［J］.J Immunol，2010，185(2):842-855.

［26］ Martinez GJ，Zhang Z，Reynolds JM，et al.Smad2 Positively Regulates the Generation of Thl 7 Cells［J］.J BiolChem，2010，285(38):29039-29043.

［27］ fantini MC，Becker C，Monteleone G，et al.Cutting edge:TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25+T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7 ［J］.J Immunol，2004，172(9):5149-5153.