抗癲疒間肽納米粒的制備及體外釋藥性能的研究

王石健，王彬輝，章文紅，張曉芬，吳 敏

0 引言

抗癲疒間肽(Anti-epilepsy peptide，AEP)是從東亞鉗蝎粗毒液中分離的一種具有生物學活性的多肽，分子量為8 300 Da，有良好的抗癲疒間作用，具有作用強、用量小、毒性低等特點[1]。但AEP為水溶性大分子蛋白多肽類藥物，很難透過血腦屏障入腦，因此，改變AEP在體內分布，增加其在病灶藥物濃度是關鍵。

聚乙二醇-聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物[Polyethyleneglycol-modified poly(d,l-lactide-co-glycolide)，PEG-PLGA]是一種新型的兩親性嵌段共聚物，既可有效延緩藥物釋放，又可顯著改善藥物在體內的分布，是具有較強靶向作用的載體。PLGA是一種生物相容性好、可生物降解的高分子材料，在體內代謝為H2O和CO2，被FDA批準用于臨床[2-3]。但PLGA納米粒因其疏水性迅速被網狀內皮系統清除，而采用PEG 修飾PLGA，使PEG-PLGA成為兩親性嵌段共聚物，可延長所載藥物在體循環中的滯留時間，且制備過程中不使用添加劑，避免了由此產生的毒性[4-5]。本實驗以PEG-PLGA為載體，采用復乳-溶劑揮發法制備AEP納米粒。

1 材料

1.1 藥品與試劑 PEG-PLGA(Mw=2000-35000，山東濟南岱罡生物科技有限公司，批號：12132016)；異硫氰酸熒光素標記的抗癲疒間肽(Fluorescein isothiocyanate-Anti-epilepsy Peptide，FITC-AEP，杭州中泰生物技術有限公司標記，批號：CH-1200612)，泊洛沙姆188(Poloxamer 188，德國BASF公司，批號：WPAF538B)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 HJ-6B多頭磁力加熱攪拌機(金壇市金偉實驗儀器廠)；Optima超速低溫離心機(美國Beckman公司)；Marvern measurement粒度測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本Jeol公司)；Labconco冷凍干燥機(英國LABCONCO公司)；熒光檢測器(日本Shimadzu公司)。

2 方法與結果

2.1 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs制備 精密稱取10 mg FITC-AEP溶于10 mL蒸餾水作為水相，100 mg PEG-PLGA溶于2 mL丙酮-乙醇(丙酮-乙醇體積比為3∶1)作為油相，把水相緩慢加入油相中，冰浴條件下超聲60 s(功率500 W，工作1.5 s，間歇2 s)，形成W1/O，為初乳。將初乳加入到泊洛沙姆188水相溶液中，冰浴條件下超聲形成W1/O/W2的復乳。室溫磁力攪拌復乳揮去有機溶劑，即得FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs溶液。40 000 r/min低溫超速離心60 min(4 ℃)，沉淀物用蒸餾水洗滌3次，凍干即得FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs。

2.2 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs含量的測定

2.2.1 熒光測定條件 采用熒光分光光度法測定FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs含量：激發波長：λex=494 nrn；發射波長：λem=518 nm。

2.2.2 線性關系 精密稱取FITC-AEP溶于蒸餾水，置10 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，定容，搖勻，并分別稀釋成濃度為0.05、0.25、0.5、1、2、5 μg/mL，按“2.2.1”熒光測定條件測定熒光強度。以藥物濃度X為橫坐標、熒光強度Y為縱坐標，進行線性回歸。得回歸方程為Y=101.58 X-0.341，r=0.999 8(n=6)。結果表明，FITC-AEP在0.05～5 μg/mL范圍內與熒光強度呈良好線性關系。

2.3 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs包封率及載藥量測定 稱取一定量FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs凍干粉，記Xt；離心前測定熒光值，記Y1，根據回歸方程，換算成AEP含量；低溫超速離心(3 ℃，35 000 r/min，40 min)后，測定上清液測定熒光值，記Y2，根據回歸方程，換算成AEP含量，記X2。按式1、2計算包封率與載藥量。

包封率%=(X1-X2)/X1×100%……式1

載藥量%=(X1-X2)/Xt×100%……式2

X1：NPs中AEP量；X2：NPs中的游離AEP量；Xt：凍干粉量。

2.4 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs制備工藝優化 在單因素試驗的基礎上，選擇FITC-AEP用量(A)、PEG-PLGA濃度(B)、丙酮-乙醇比例(C)、復乳超聲時間(D)為試驗因素，各因素選取3個水平，按正交設計表L9(34)安排試驗，正交設計因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

以粒徑、包封率與載藥量為考察指標，應用綜合加權評分法對正交試驗結果進行綜合分析，粒徑(y1)、包封率(y2)和載藥量(y3)分別按30%、35%和35%的系數積分，綜合評分(y)=35×(1-y1/168.2)+30×y2/83.5+35×y3/6.87，通過直觀分析及方差分析，優選最佳的工藝，結果見表2、表3。

表2 正交試驗方案和結果

表3 方差分析表

由表3方差可知，FITC-AEP用量(A)、PEG-PLGA濃度(B)、復乳超聲時間(D)對FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs的制備工藝有顯著性影響。綜合各因素K值，確定最佳制備工藝為 A2B3C2D2，即FITC-AEP用量20 mg、PEG-PLGA濃度50 mg/mL、丙酮-乙醇比例3∶1、復乳超聲時間60 s。

2.5 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs制備工藝驗證 按正交試驗優化的工藝制備3批FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs，考察工藝穩定性，結果見表4。

表4 制備工藝驗證

2.6 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs形態 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs凍干粉加蒸餾水溶解，溶液滴于銅網上，靜置15 min后用濾紙吸干，以3.0%磷鎢酸溶液于銅網上負染10 min后，透射電子顯微鏡形態，見圖1。由圖1可見，FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs呈圓形或類圓形，表面光滑圓整。

2.7 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs體外釋放 采用動態透析袋法研究FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs體外釋藥特性。精密量取FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs凍干粉適量(含AEP 1 mg)溶解于pH 7.4 PBS溶液，置于已處理過的透析袋內，扎緊袋口，將含藥透析袋置于250 mL釋放介質中，37 ℃恒溫水浴振蕩(75 r/min)，于0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、18、24、48 h取樣0.2 mL，立即補加等量同溫釋放介質。按“2.2.1”熒光測定條件測定，并計算累積釋放曲線，見圖2。

由圖2可知，FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs 在pH 7.4 PBS緩沖液中的釋藥行為呈現突釋和緩釋兩個階段，前3 h屬于突釋階段，藥物釋放39.7%左右。隨后釋放趨向平緩，48 h時藥物釋放85.3%。分別用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程和Weibull方程對其體外釋藥進行擬合，結果體外釋放符合Weibull釋放模型，Weibull方程為lnln(1/1-Q)=0.675 4lnt-1.279 3(r=0.991 8)。

圖1 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs透射電鏡照片

圖2 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs體外釋藥曲線

3 討論

3.1 癲疒間是一組因大腦病灶神經元過度放電所致的中樞神經系統功能短暫失調的腦部疾病，具有慢性、反復發作的特點，是神經系統的常見病、難治病。AEP從蝎毒粗毒中分離、純化出來，由61個氨基酸殘基組成，藥理研究表明其是一種具有抗癲疒間活性的多肽，對各型癲疒間均具有較強的治療作用，且其與傳統抗癲疒間藥如苯妥英鈉、卡馬西平等相比，具有毒性小、作用強的優點，是一種理想的抗癲疒間藥[6-7]。但AEP為水溶性大分子多肽，不易透過BBB到達神經中樞發揮抗癲疒間作用。新型的納米藥物載體用于抗癲疒間藥物的輸送，既可提高抗癲疒間藥的效能，還能降低抗癲疒間藥的毒副作用。

3.2 嵌段共聚物是單一線性共聚物分子中存在兩種或兩種以上結構不同的鏈段單元按照一定序列組成的聚合物。兩親性嵌段共聚物是一種新型的納米藥物載體，具有很高的內核載藥容量和獨特的體內分布特征，在結構上可以劃分出親水部分和疏水部分。由于這種獨特的化學結構，在水溶液中能形成具有球形內核-外殼結構的共聚物膠束。內核可以作為儲存藥物的容器，降低毒副作用，外殼可對藥物起保護作用，提高藥物的穩定性，并且達到緩釋作用[5-8]。

3.3 本研究在預試驗的基礎上，結合抗癲疒間肽的水溶性性質，最終確定W1/O/W2復乳-溶劑揮發法。本研究所述復乳法具體為將載體材料PEG-PLGA溶解在有機溶劑中，將藥物水溶液分散在其中，形成W1/O型初乳，再在攪拌條件下將初乳分散到含有表面活性劑的水溶液中，形成W1/O/W2型乳液。該法制備的納米粒包封率為64.46%，粒徑為100.2 nm，PDI為0.111。分析其原因，可能是因為：①采用本法制備的納米粒由于內水相與外水相被油相隔開，可以避免藥物向外水相擴散從而包封率提高；②在外水相中加入的poloxamer188有空間位阻作用，可以阻止納米粒的聚集，增加穩定性。

3.4 由體外釋藥曲線可知，FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs在pH 7.4 PBS緩沖液中的釋藥行為呈突釋和緩釋兩個階段：第一階段3 h時藥物釋放39.7%，存在一定突釋現象，可能由于AEP吸附在納米粒表面，或者只是以較弱的鍵連接在納米粒表面，使得藥物從透析袋中釋放比較快；第二階段曲線趨向平緩，48 h時藥物釋放85.3%，可能由于大部分AEP進入納米粒內核，隨著載體材料逐漸降解，外液逐步擴散到納米粒內部并攜帶藥物向介質擴散，釋放AEP。考慮到PLGA降解速度較慢，同時在釋放過程中外液滲入導致內部結構變密，外液滲入受阻，導致AEP釋放速度緩慢，呈現緩釋現象。

參考文獻：

[1] 王宗仁,邵中軍,李晶華,等.抗癲疒間肽重組腺伴病毒載體的構建及鑒定[J].中草藥,2005,36(12)1844-1846.

[2] Yu L,Ci T,Zhou S,et al.The thermogelling PLGA-PEG-PLGA block copolymer as a sustained release matrix of doxorubicin[J].Biomater Sci,2013,4(10):411-420.

[3] Lü JM,Wang X,Marin-Muller C,et al.Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology[J].Expert Rev Mol Diagn,2009,9(4):325-341.

[4] Li M,Panagi Z,Avgoustakis K,et al.Physiologically based pharmacokinetic modeling of PLGA nanoparticles with varied mPEG content[J].Int J Nanomedicine,2012，(7):1345-1356.

[5] Betancourt T,Byrne JD,Sunaryo N,et al.PEGylation strategies for active targeting of PLA/PLGA nanoparticles[J].J Biomed Mater Res,2009,91(1):263-276.

[6] Joseph B,George J.Scorpion toxins and its applications[J].Int J Toxi Pharm Res,2012,4(3):57-61.

[7] Wang Z,Wang W,Shao Z,et al.Eukaryotic expression and purification of anti-epilepsy peptide of Buthus martensii Karsch and its protein interactions[J].Mol Cell Biochem,2009,330(1-2):97-104.

[8] Wen JG,Guo TT,Zhu HY,et al.Preparation and optimization of PEG-PLGA loaded with vincristine sulfate and itsinvitrrelease[J].J Bioequiv Availab,2011,3(9):211-214.