MEA與FLAG方案治療難治性復發性急性髓系白血病療效及安全性分析

章 亮,周 暉,陳小會

0 引言

難治性復發性急性髓系白血病(Refractory and relapse acute myeloid leukemia，rrAML)是成人惡性血液疾病的主要類型，預后較差。藥物聯合化療仍是rrAML的主要治療手段[1]。當前rrAML的化療方案主要有米托蒽醌+依托泊苷+阿糖胞苷(Mitoxantrone+etoposid+cytarabine,MEA)方案及氟達拉濱+阿糖胞苷+重組人粒細胞集落刺激因子(Fludaraine+cytarabine+recombinant human granulocyte colony stimulating factor,FLAG)方案，但臨床仍缺乏兩種方案治療rrAML療效及安全性的系統性比較及評價。本研究對rrAML患者分別按照MEA、FLAG方案化療，比較兩種化療方案的療效及安全性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年6月至2013年6月在本院治療的rrAML患者68例。入選標準：①符合《惡性血液病診治和療效標準》中相關診斷標準[2]，并經流式細胞術、骨髓形態學、染色體、融合基因檢查確診；②按標準方案誘導治療2個療程后無效，或第1次完全緩解后在6～12個月內復發(早期復發)及12個月后復發(晚期復發)，或復發≥2次；③體能狀態(ECOG)≤2分；④簽署知情同意書。排除標準：①伴有嚴重心、肝、肺疾病或惡性腫瘤；②合并嚴重感染或代謝性疾病；③首次發病的AML患者；④其他類型的白血病患者；⑤M3型AML；⑥已發展至晚期，無治愈希望者。將68例患者采用SPSS 17.0產生的隨機數字表隨機分為2組，每組34例，兩組年齡、性別、白細胞計數(WBC)、復發病程、分型等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較(例，%)

1.2 化療方法 MEA組按照MEA方案化療。米托蒽醌(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：65271809)靜脈滴注，10 mg/d，第1～3天；阿糖胞苷[上海醫藥(集團)有限公司華聯制藥廠，批號:147944]靜脈滴注，100～150 mg/(m2·d)，第1～7天；依托泊苷(四川三精升和制藥有限公司，批號：33419420)靜脈滴注，100 mg/d，第1～5天。

FLAG組按照FLAG方案化療。氟達拉濱(揚州奧賽康藥業有限公司，批號：75607679)靜脈滴注，50 mg/d，第1～5天；阿糖胞苷[上海醫藥(集團)有限公司華聯制藥廠，批號:147944]靜脈滴注，100 mg/(m2·d)，第1～5天；重組人粒細胞集落刺激因子(齊魯制藥廠，批號：135968091)皮下注射，300 μg/d，第0～5天。

兩組在按上述化療方案治療基礎上，均給予地西他濱 20 mg/(m2·d)，qd×(5～9)d去甲基化治療，維持1 h以上。在化療期間對癥給予水化、堿化、保護臟器、漱口、坐浴、止吐、抗感染等治療。兩組均化療1個療程后評價療效。

1.3 觀察指標 在化療期間嚴密監測血常規、凝血功能、電解質、肝腎功能，并進行心電圖、胸部CT、腹部超聲、骨髓穿刺等檢查，記錄感染、敗血癥、粒細胞缺乏及腹瀉、發熱、口腔炎等非血液學毒副反應發生情況。化療1個周期結束后，次日根據臨床表現、血象、骨髓象評價化療效果。化療效果評價參考《惡性血液病診治和療效標準》分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、未緩解(NR)，總緩解=CR+PR。

1.4 ID4基因甲基化檢測 化療前均收集兩組患者骨髓以備用。取兩組中CR患者化療前及化療后的骨髓標本，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)、Methylight-PCR對ID4基因甲基化進行定性及定量檢測。

1.4.1 MS-PCR檢測 ①引物設計：ID4基因甲基化特異性引物參照文獻[3]設計，由上海捷瑞生物技術有限責任公司合成，擴增片段長度186 bp。②PCR反應：PCR反應總體積25 μL，包含上游、下游引物各25 pmol/L，2×GoTaqGreen master mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，補充無菌雙蒸水至25 μL。反應條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；隨后經72 ℃延伸7 min完成擴增。

1.4.2 Methylight-PCR檢測 ①引物設計：MYOD1作為內參基因，引物及探針參考文獻[3]設計，由上海捷瑞生物技術有限責任公司合成。②PCR反應：PCR反應總體積20 μL，包含ID4基因甲基化特異性引物及探針各50 pmol，2×EpiTectMethylight Master mix 10 μL，補充無菌雙蒸水至20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s；于60 ℃進行FAM熒光收集。

通過-△Ct=-(Ct甲基化-Ct內參)計算ID4基因甲基化水平，-△Ct越大ID4基因甲基化程度越高[4]。

2 結果

2.1 化療效果 經過1個療程化療后，FLAG組總緩解率為70.95%，高于MEA組的52.94%，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2 不良反應發生情況 兩組化療后敗血癥、非血液學毒性反應發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)；FLAG組侵襲性真菌病、粒細胞缺乏發生率高于MEA組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。FLAG組感染性發熱、粒細胞缺乏持續時間分別為(8.72±2.01)d、(20.44±3.50)d，長于MEA組的(6.55±1.78)d、(18.27±2.87)d，兩組比較差異有統計學意義(t1=2.80，t2=3.32,P均<0.05)。

表2 兩組治療效果比較(例，%)

表3 兩組不良反應發生率比較(例，%)

2.3 化療前、后ID4基因甲基化水平 MEA組經化療后7例達CR，FLAG組10例達CR，兩組CR患者化療前ID4基因甲基化水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，化療后FLAG組CR患者ID4基因甲基化水平低于MEA組的CR患者，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 兩組CR患者化療前、后ID4基因甲基化水平比較

3 討論

AML約占成人白血病的75%，多耐藥細胞株的產生使得AML治療反復失敗，并發展成為rrAML[5]。異基因造血干細胞移植是目前治療rrAML最有效的方法，但此前的再誘導緩解仍然需要化療藥物實現。目前臨床治療rrAML的化療藥物主要是大劑量的阿糖胞苷聯合二線藥物、二線藥物聯合化療或聯合靶向治療新藥等，其中以MEA、FLAG等方案化療較為常見，但臨床仍缺乏兩種方案治療rrAML的療效及安全性的系統性評價。

余丹等[6]研究發現，MEA與FLAG治療1個療程后，總緩解率分別為61.14%、64.38%，差異無統計學意義；而治療2個療程后，FLAG方案組總緩解率為82.34%，高于MEA方案組的66.13%，差異有統計學意義(P<0.05)，但FLAG方案組骨髓抑制發生率高于MEA方案組，持續時間也較長。Takami等[7]研究也得到相似結論，米托蒽醌、依托泊苷與阿糖胞苷較少發生交叉耐藥，毒副反應較少，但治療1～2個療程后，總緩解率不如FLAG方案高。本研究中，經1個療程化療后，FLAG組總緩解率為70.95%，高于MEA組的52.94%，差異有統計學意義(P<0.05)，與余丹等報道基本相符，提示FLAG方案治療rrAML效果優于MEA。兩種化療方案中均應用大劑量阿糖胞苷。阿糖胞苷是作用于細胞周期S期的特異性藥物，其療效主要依賴于癌細胞內活性成分單磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)的濃度，劑量越大其直達癌細胞細胞核中的濃度就越大，對癌細胞的殺傷作用越大[8]。Claus等[9]研究發現，氟達拉濱可協同阿糖胞苷,使阿糖胞苷在rrAML中的Ara-CTP濃度增加2～7倍，同時氟達拉濱對耐藥的細胞有直接毒性作用，抑制癌細胞DNA修復，增強癌細胞殺傷作用。而近年研究也發現，重組人粒細胞集落刺激因子可使0期癌細胞進入S期，提高阿糖胞苷的化療敏感性[10]。這也許是FLAG方案治療rrAML療效優于MEA方案的主要原因。

值得注意的是，阿糖胞苷對癌細胞的殺傷作用具有劑量依賴性，其對正常細胞的毒性作用也呈劑量依賴性。雖然FLAG治療rrAML的總緩解率更高，但感染與骨髓抑制發生率也顯著升高。葛健等[11]研究發現，對rrAML患者按FLAG方案化療1個療程后，粒細胞缺乏、感染發生率分別達50.03%、59.35%，非血液學毒副反應發生率也較高，但程度均較輕。本研究中，FLAG組將阿糖胞苷的劑量適當調低，為100 mg/(m2·d)，低于MEA組的150 mg/(m2·d)，化療后感染、粒細胞缺乏發生率分別為47.06%、52.94%，略低于葛健等報道水平，但仍高于MEA組，且持續時間也長于MEA組。此外，國外學者研究認為，FLAG方案的骨髓抑制作用不僅與阿糖胞苷有關，還可能與氟達拉濱有關。Fedele等[12]對rrAML采用FLAG方案誘導，隨后采用去氟達拉濱方案鞏固，結果66%以上的患者仍采集到足夠的CD34+細胞。而以FLAG方案誘導，以去阿糖胞苷為鞏固方案，結果又有69%以上的患者未采集到足夠的CD34+細胞。因此Fedele等認為，氟達拉濱會損傷患者的造血干細胞，但其機制有待進一步研究。

AML的發病與發展與基因缺失、突變密切相關。人體ID4基因甲基化與實體瘤，如直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等轉移及復發密切相關。近年研究發現，在非霍奇金淋巴瘤、AML中檢測到ID4基因甲基化提示有復發可能[9,13-14]。這些研究提示：靶向誘導抑癌基因的表達有可能成為AML治療的新途徑。楊華等[15]研究報道，在23例rrAML患者中，14例檢出ID4基因甲基化陽性，陽性率為60.87%，給予地西他濱等去甲基化藥物化療后，ID4基因甲基化水平顯著下降。本研究對兩組患者分別按MEA、FLAG治療基礎上給予去甲基化藥物地西他濱治療，化療后ID4基因去甲基化水平均有所下降，但FLAG組ID4基因去甲基化水平下降更明顯。于錦香等[16]研究發現，地西他濱單藥化療的CR率為60.13%，地西他濱聯合CAG化療的CR率為72.96%。蔡成森等[14]也得到相似結論，地西他濱聯合AAG方案化療的療效優于地西他濱。上述研究得出一個結論，其他化療藥物有可能提高地西他濱的去甲基化功能。本研究中，FLAG組經化療后，ID4基因甲基化水平顯著低于MEA組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示FLAG方案對地西他濱去甲基化的增強作用優于MEA，這可能也是FLAG方案治療效果優于MEA方案的一個原因，但其機制有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Sepehrizadeh Z,Mohammadi M,Emami A,et al.Assessment of cytokine expression profile in acute myeloid leukemia patients before and after chemotherapy[J].Turk J Haematol,2014,31(2):149-154.

[2] 林鳳茹,郭曉楠,任金海.惡性血液病診治和療效標準[M].第2版.北京:人民軍醫出版社,2009:216-240.

[3] 劉洋,康慧媛,王莉莉,等.急性白血病細胞中ID4基因甲基化的PCR定量檢測系統的建立及其特異性和敏感性[J].中國實驗血液學雜志,2014,22(2):269-274.

[5] Aref S,Sharawy SE,Sabry M,et al.Wilms tumor 1 gene mutations in patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia[J].Turk J Haematol,2014,31(2):143-148.

[5] Kim H,Lee JH,Joo YD.Prospective,Multicenter,Phase Ⅱ study on reducing the dosage of idarubicin and FLAG for patients younger than 65 years with resistant acute myeloid leukemia:a comparison with a higher dosage trial[J].Acta Haematol,2014,132(1):87-96.

[6] 余丹,張念,易雪,等.FLAG和MEA方案治療難治復發性急性髓系白血病療效分析[J].中華實用診斷與治療雜志,2013,28(11):1076-1077.

[7] Takami A,Yano S,Yokoyama H,et al.Donor lymphocyte infusion for the treatment of relapsed acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation:A retrospective analysis by the Adult AML Working Group of the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation[J].Biol Blood Marrow Transplant,2014,14(7):112-120.

[8] 郭智,何學鵬,陳惠仁,等.不同劑量阿糖胞苷維持治療對老年急性髓系白血病預后的影響[J].中國醫藥,2012,7(11):1388-1390.

[9] Claus R,Wilop S,Hielscher T,et al.A systematic comparison of quantitative high-resolution DNA methylation analysis and methylation-specific PCR[J].Epigenetics,2012,7(7):772-780.

[10]王萍,葛守輩,劉曉娟,等.重組人白細胞介素-11治療急性髓系白血病化療后血小板減少效果觀察[J].中華實用診斷與治療雜志,2014,28(3):301-302.

[11]葛健,曾慶曙,楊明珍,等.CAG與FLAG方案治療難治或復發急性髓系白血病的療效初步研究[J].安徽醫學,2012,33(3):268-270.

[12]Fedele R,Messina G,Martinello T,et al.Tolerability and efficacy of busulfan and fludarabine as allogeneic pretransplant conditioning therapy in acute myeloid leukemia:comparison with busulfan and cyclophosphamide regimen[J].Clin Lymphoma Myeloma Leuk,2014,11(7):215-221.

[13]劉秉珊,郭緒濤,查潔,等.急性髓系白血病MDR1和BAALC基因表達水平及其預后意義的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(21):1691-1695.

[14]蔡成森,孫愛寧,仇惠英,等.地西他濱單藥及聯合AAG方案治療初治急性髓系白血病的臨床觀察[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2012,6(19):6092-6094.

[15]楊華,朱海燕,姜孟孟,等.地西他濱治療骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病的臨床觀察[J].中國實驗血液學雜志,2013,21(1):121-125.

[16]于錦香,蔡冬梅,王曉雪,等.地西他濱聯合CAG治療老年急性髓系白血病的療效觀察[J].實用藥物與臨床,2013,16(3):211-213.