他克莫司膠囊微生物限度檢查法驗證的探討

占景華，石鶴坤，鐘淵福，董智聰，胡永獅*

0 引言

他克莫司(Tacrolimus,FK-506)最早由日本藤澤藥品工業公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌(Streptomyces tsskibaensis)NO9993的發酵液中提取，是含氮23元環的大環內酯類強效免疫抑制劑[1]。目前，已廣泛應用于肝臟、胰腺、腎臟、心臟和肺等實體器官移植后的抗排異治療，其藥理作用是有效抑制T細胞激活，與內源性細胞受體(FKBP12)結合形成一個親免素immunophilins復合物，從而發揮藥理作用[2]。

由于他克莫司是一種上市不久的新型免疫抑制劑，所以關于他克莫司膠囊的檢測方法報道相對較少，為了保證他克莫司膠囊的微生物限度檢測法的準確性和可靠性，減少患者健康潛在的危害，保證在生產、貯存、銷售過程中的質量，現按照2010版《中國藥典》二部附錄微生物限度檢查法有關規定[3]，通過系列試驗，考察了他克莫司膠囊的抑菌活性和微生物檢查法，并建立適合于該制劑的微生物限度檢查方法，為制劑的進一步開發提供依據。

1 試驗材料

1.1 樣品 他克莫司膠囊分別由杭州中美華東制藥有限公司(批號：13401，樣品1)、安斯泰來制藥有限公司(批號：OD5606A，樣品2)、浙江海正藥業股份有限公司(批號：20130311，樣品3)提供。

1.2 驗證用菌種 枯草桿菌CMCC 63202-4a(第三代)，金黃色葡萄球菌CMCC 26003-28(第三代)，大腸埃希菌CMCC 44102-22(第三代)，白色念珠菌CMCC(F)98001(第三代)，黑曲霉CMCC(F)98003(第三代)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養基 營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、真菌瓊脂培養基、改良馬丁培養基、膽鹽乳糖培養基、營養肉湯培養基、真菌培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基和甘露醇氯化鈉瓊脂培養基均由中國藥品生物制品檢定所生產，按使用說明書配制。

1.4 設備 ES-315全自動滅菌鍋(TOMY)、SW-CJ-1FD醫用凈化工作臺(蘇州康萊特凈化工程有限公司)、ZW-2008集菌儀(溫州維科生物實驗設備有限公司)、KBF220一次性使用集菌過濾培養器(溫州維科生物實驗設備有限公司)、恒溫培養箱(THERMO)。

2 方法

2.1 菌液制備 分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，經30～35 ℃培養18～24 h后，分別取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養物1 mL+9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至106～107，細菌數約為50～100 cfu/mL，做活菌計數備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，經23～28 ℃培養24～48 h后，取白色念珠菌液體培養物1 mL+9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至104～107，菌數約為50～100 cfu/mL，做活菌計數備用。

接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，經23～28 ℃培養5～7 d后，取黑曲霉斜面培養物，加3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液1 mL +9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至104，菌數約為50～100 cfu/mL，做活菌計數備用。

2.2 供試液制備 稱取樣品5 g，加0.5%吐溫80蛋白胨水氯化鈉緩沖液至45 mL，作為1∶10供試液。

2.3 回收率測定(平皿計數法)

2.3.1 常規法 試驗組：取1∶10供試液1 mL、50～100個/mL試驗菌液1 mL同時加入平皿中，立即傾注15～20 mL溫度不超過45 ℃的培養基中，待凝固后，置培養基觀察結果，同時平行3個平皿。供品對照：取1∶10供試液各1 mL分別加入至平皿中，立即傾注15～20 mL溫度不超過45 ℃的培養基，待凝固后，置培養觀察結果。稀釋劑對照：取稀釋液1 mL替代供試品，加入50～100個試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。

2.3.2 0.2 mL/皿稀釋法 取1∶10的供試液1 mL分注于5個平皿(即0.2 mL/皿)中，于每皿中分別加入1 mL含有50～100個的試驗菌，立即傾注45 ℃相應的培養基，每株試驗菌平行制備3個平皿，按平皿法測定其菌數。

2.3.3 薄膜過濾法 試驗組：每管分別取已制成的1∶10供試液10 mL，全量過濾(蠕動泵轉速160 r/min)，用無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗500 mL或1 L，等瓶底留沖洗液20 mL左右時，分別加入各試驗菌液1 mL，混勻，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，35 ℃培養48 h觀察結果或25 ℃ 72 h觀察結果。稀釋劑對照組：取稀釋劑各100 mL，分別加入上述試驗菌，使菌濃度為50～100 cfu/mL，按試驗組的方法進行菌落計數。供試品對照組：按試驗組方法處理，但不加菌液。

2.3.4 計算方法 試驗組的菌回收率(%)=[(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數]×100%

3 結果

3.1 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(常規法)(1∶10) 他克莫司膠囊3個樣品常規平皿培養法微生物限度檢查的驗證結果見表1。從表1可以看出：采用常規方法檢驗他克莫司膠囊供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率試驗均低于70%，有一定抑菌作用，不能采用常規方法檢驗。根據驗證試驗結果，確定他克莫司膠囊微生物限度檢查法為細菌數和霉菌數測定均不能采用常規方法檢驗。

表1 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(常規法)(1∶10)

3.2 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(常規法)0.2 mL稀釋法 他克莫司膠囊3個樣品稀釋法0.2 mL/皿微生物限度檢查的驗證結果見表2。從表2可以看出：采用稀釋法0.2 mL/皿檢驗他克莫司膠囊供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對枯草桿菌的回收率高于70%；而對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率試驗均低于70%，有一定抑菌作用，不能采用稀釋法0.2 mL/皿檢驗。根據驗證試驗結果，確定他克莫司膠囊微生物限度檢查法為細菌數和霉菌酵母菌數測定均不能采用稀釋法0.2 mL/皿檢驗。

表2 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(常規法)0.2 mL稀釋法

3.3 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(薄膜過濾法1∶10，沖洗500 mL) 他克莫司膠囊3個樣品薄膜過濾法(1∶10)微生物限度檢查的驗證結果見表3。上述試驗結果表明，他克莫司膠囊微生物限度檢查菌落計數采用薄膜過濾法供試液1∶10，沖洗500 mL，除黑曲霉外，試驗組的各試驗菌回收率均在70%以上。

表3 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(薄膜過濾法1∶10，沖洗500 mL)

3.4 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(薄膜過濾法1∶100、1∶1 000，沖洗500 mL) 見表4、表5。表4結果顯示，采用薄膜過濾法供試液1∶100；沖洗500 mL，供試品對黑曲霉回收率低于70%。表5結果顯示，采用薄膜過濾法供試液1∶1 000；沖洗500 mL，供試品對黑曲霉回收率高于70%。

表4 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(薄膜過濾法1∶100，沖洗500 mL)

表5 他克莫司膠囊微生物檢測回收率(薄膜過濾法1∶1 000，沖洗500 mL)

4 結論

微生物限度方法驗證是確認供試品在所采用的檢查方法和檢驗條件下無抑菌作用，以保證供試品污染的微生物能被充分檢驗出來[4]。藥物具有抑菌成分的進行微生物限度檢查時，要求供試品本身在試驗的條件下有效排除其抑菌作用，使其在不干擾染菌的限度檢驗，結果方屬有效[5]。

他克莫司膠囊按照2010年版《中國藥典》微生物限度檢查法驗證方法驗證，結果如下，細菌總數：取供試品5 g，加無菌0.5%吐溫80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至45 mL，振搖混勻，制成1∶10供試液；取供試液1 mL，全量過濾(蠕動泵轉速160 r/min)，用無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL沖洗，取出濾膜菌面朝上貼于營養瓊脂培養基，35 ℃培養48 h，計數菌落。霉菌和酵母菌：另取1∶10供試液1 mL，加入到100 mL的無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，取1 mL，全量過濾(蠕動泵轉速160 r/min)，用無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL沖洗，取出濾膜菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養基，25 ℃培養72 h，計數菌落。

在菌落計數方法驗證中，大腸埃希菌代表革蘭陰性菌，金黃色葡萄球菌代表革蘭陽性菌，枯草芽孢桿菌代表芽孢桿菌，白色鏈球菌代表酵母菌，黑曲霉代表霉菌，因此，該驗證方法較能體現出檢測方法的準確性，減少檢測方法誤差[6-7]。建議不同檢測樣品進行微生物限度檢測都必須進行方法驗證，避免采用單一常規法或膜過濾法進行微生物限度檢測，使實驗科學合理，提高工作效率，更加規范性。

參考文獻：

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[2] 周立明,張莉,趙曉娟,等.他克莫司自微乳的制備和質量評價[J].中國醫院藥學雜志,2012,32(24):1975-1979.

[3] 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典[S].2010年版.北京:化學工業出版社,2010:附錄107-115.

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[5] 黃依玲.醫院制劑微生物限度檢查方法的重新驗證[J].中國現代藥物應用,2013,7(9):3-4.

[6] 由亞寧,任安民,斐為芝.藥品微生物驗證枯草芽孢桿菌實驗菌液制備方法的探討[J].西北藥學雜志,2007,22(6):345.

[7] 范兵,杜娟,陳林芳.黃藤片微生物檢驗方法驗證中加菌方法的比較研究[J].兒科藥學雜志,2007,13(1):37-38.