TLR4-p38MAPK信號(hào)通路在金黃色葡萄球菌感染人巨噬細(xì)胞系U937過(guò)程中的表達(dá)及意義

王佳賀,岳冬梅,何 平*

0 引言

金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌，Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染最常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性致病菌[1-3]。研究表明，外界刺激因子對(duì)免疫細(xì)胞行為的調(diào)解主要與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化有關(guān)[4]。金黃色葡萄球菌感染后，通過(guò)Toll 樣受體(TLR)的識(shí)別引起炎癥反應(yīng)，但其信號(hào)通路尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)在原有的工作基礎(chǔ)之上，通過(guò)金黃色葡萄球菌感染人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞，研究金黃色葡萄球菌對(duì)單核巨噬細(xì)胞表面TLR4的活化作用；并給予特異性 p38 蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的抑制劑，探討針對(duì)p38MAPK的干預(yù)對(duì)TLR4和p38MAPK蛋白表達(dá)的影響，觀察TLR4-p38MAPK信號(hào)通路的變化，對(duì) TLR4-p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制與金黃色葡萄球菌感染的關(guān)系進(jìn)行初步探討，為金黃色葡萄球菌所致疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;p38MAPK 特異性抑制劑SB203580(CalBiochem公司)，以二甲基亞砜(DMSO)溶解，使用前以生理鹽水稀釋?zhuān)笵MSO 的終濃度為2%，SB203580 的終濃度為5 mg/mL或10 mg/mL；其他所有試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Backman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、100%濕度的條件下，于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI(Roswell park memorial Institute)-1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶約90%時(shí)，用培養(yǎng)液將其稀釋3倍，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng) 將凍存于甘油中的金黃色葡萄球菌Wood46按照1∶100的比例接種于CYGP培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜活化。在金黃色葡萄球菌感染U937細(xì)胞0、30、60 和90 min后收集細(xì)胞。

1.4 Western blot 檢測(cè)TLR4和p38MAPK蛋白的表達(dá) 人外周血單核細(xì)胞處理一定時(shí)間后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，沉淀物在冰上用裂解液重懸20 min。等量蛋白用體積分?jǐn)?shù)12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h。質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%脫脂奶粉室溫封閉1 h;用TLR4，磷酸化p38MAPK，非磷酸化p38MAPK蛋白等一抗，4 ℃孵育過(guò)夜;磷酸鹽緩沖液漂洗3次后加二抗，室溫孵育2 h;化學(xué)發(fā)光法顯色，并進(jìn)行掃描分析，同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較用最小顯著差法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌Wood46刺激后可以活化U937細(xì)胞中TLR4-p38MAPK信號(hào)通路 結(jié)果顯示，TLR4和p-p38MAPK表達(dá)于U937細(xì)胞上，見(jiàn)圖1。金黃色葡萄球菌Wood46感染后，TLR4和p-p38MAPK的表達(dá)水平隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明在U937細(xì)胞中金葡菌Wood46可以活化TLR4-p38MAPK信號(hào)通路。

2.2 P38MAPK信號(hào)通路在金黃色葡萄球菌Wood46誘導(dǎo)U937細(xì)胞表達(dá)TLR4和p-p38MAPK的過(guò)程中起著重要作用：當(dāng)SB203580的濃度分別為5 mg/mL或10 mg/mL時(shí)，可以顯著下調(diào)TLR4的表達(dá)和p-p38MAPK的磷酸化水平(圖 2)。

圖1 金黃色葡萄球菌Wood46誘導(dǎo)U937細(xì)胞中TLR4和p-p38MAPK的表達(dá)上調(diào)

圖2 特異性p38MAPK抑制劑對(duì)金黃色葡萄球菌Wood46誘導(dǎo)活化TLR4和p-p38MAPK通路的影響

3 討論

近年來(lái)，隨著病原菌與宿主免疫細(xì)胞相互作用研究的深入，能夠介導(dǎo)細(xì)菌毒力因子抑制或活化宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的細(xì)胞表面蛋白日漸成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的天然免疫的病原識(shí)別受體。它們可以通過(guò)廣泛地特異性識(shí)別病原微生物，偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并激活天然免疫細(xì)胞，最終導(dǎo)致一系列的免疫炎癥反應(yīng)[5]。TLRs 主要經(jīng)以下兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑:TLRs-髓系分化蛋白(MyD88)/白細(xì)胞介素-1(IL-1)-受體相關(guān)激酶(IRAK)-核因子-κB(NF-κB)誘導(dǎo)激酶(NIK)/NF-κB 途徑;TLRs-MyD88/IRAK-絲裂原活化激酶途徑[5-7]。其中TLR4 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR，是最具代表性的TLRs受體。研究表明，TLR4 的活化可激活一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPKs 家族。MAPK級(jí)聯(lián)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)的主要信息傳遞系統(tǒng)，可將細(xì)胞外信息傳遞到細(xì)胞核中，其中，p38MAPK通路是介導(dǎo)炎癥發(fā)生的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[8-11]。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌α-毒素可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞凋亡，增加 TLR2和 TLR4的表達(dá)，在金黃色葡萄球菌的致病過(guò)程中起重要作用；我們用α-毒素蛋白純品作用于單核細(xì)胞，結(jié)果顯示，α-毒素能夠增加c-jun和c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK1/2)、p38MAPK的磷酸化水平，證明了MAPK信號(hào)通路的成員p38 MAPK和JNK1/2在金黃色葡萄球菌α-毒素的致病過(guò)程中起重要作用[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們用含有α-毒素的金黃色葡萄球菌菌株Wood46感染人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可引起TLR4和p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增高；同時(shí)也證明TLR4-p38MAPK信號(hào)通路在金黃色葡萄球菌感染的信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。同時(shí)，我們用特異性抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)，相應(yīng)地影響TLR4蛋白的表達(dá)以及p-p38MAPK蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證明了TLR4-p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與金黃色葡萄球菌感染密切相關(guān)。

綜上所述，TLR4-p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了金黃色葡萄球菌感染過(guò)程，p38MAPK在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用，針對(duì)控制TLR4-p38MAPK通路可能成為臨床上防治金黃色葡萄球菌感染的一個(gè)新思路。

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