異氟醚對乙酰膽堿誘導的細胞外信號調節激酶磷酸化的抑制效應

邢 準，張巖生，劉 坤，邱 鵬

0 引言

異氟醚是一種廣泛用于臨床的吸入全身麻醉藥物，可以對血壓、腦血流、腦代謝等有影響，甚至直接作用于神經的電傳導和物質代謝。流行病學研究發現,異氟醚能夠導致術后認知功能障礙的發生率增高，并證實是其發病的獨立危險因素之一[1-2]。吸入麻醉藥可能通過抑制神經元乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)受體發揮作用，乙酰膽堿受體包括毒蕈鹼型(mAChR) 和煙堿型(nAChR)，廣泛存在于神經系統中，與大腦的認知功能密切相關。G蛋白偶聯的乙酰膽堿受體可以激活一系列蛋白激酶，包括細胞外信號調節激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，ERK可調節突觸和神經元的可塑性及學習和長時程記憶形成[3]。蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)通路也是調控應激反應和細胞生存、凋亡的重要通路。有研究表明,吸入全身麻醉藥物可以增加蛋白激酶B磷酸化從而發揮麻醉藥預處理作用[4-5]。本研究以體外培養的神經元樣PC12細胞為基礎，研究異氟醚處理對乙酰膽堿誘導的細胞內信號傳導的影響，探討揮發性麻醉藥影響認知功能的分子機理。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM高糖培養基(美國Gibco 公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程公司)，碘化乙酰膽堿(美國Sigma公司)，異氟醚(英國雅培公司)，抗體均購自美國Santa Cruz公司。HERA CELL 150型CO2培養箱(德國Heraeus 公司)，TE2000-U 系列倒置顯微鏡(配有CCD 軟件，日本Nikon公司)，ULTIMA氣體濃度監測儀(美國Ohmeda公司)，ABI7500定量PCR儀(美國ABI公司)，Gbox-chemiHR-E電泳成像分析系統(美國Gene公司)。

1.2 培養細胞及分組 高分化的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞株購自北京金紫晶生物醫藥技術有限公司。將復蘇后的PC12 細胞接種于涂有多聚賴氨酸的75 mL 培養瓶中，培養液為含有10%新生牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素) 的DMEM 高糖培養基,在37 ℃、5 %CO2飽和濕度培養箱中生長。每3天傳代一次。取對數生長期的PC12 細胞，以4×105/mL 的密度接種于24孔板，培養箱培養18 h后更換無血清DMEM培養基，參考文獻[6]將培養板置于濃度1.2%的異氟醚密閉箱內進行處理2 h，采用ULTIMA氣體濃度監測儀監測異氟醚濃度。分別于處理后0 min、1 h、3 h加入碘化乙酰膽堿(終濃度10 μM)刺激2 min后收集細胞，-80 ℃凍存。

1.3 蛋白印跡實驗 采用RIPA buffer按照說明書分離提取細胞總蛋白，取少量BCA法測定蛋白濃度，上樣量按每孔20 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度5%，分離膠濃度8%)分離蛋白，半干法轉印至PVDF膜上(10 V,1.5 h)。轉印膜用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，與TTBS緩沖液(含1%BSA)稀釋的抗p-ERK1/2(sc-7383，1∶500)和p-PKB(sc-101775，1∶1 000))一抗溶液4 ℃雜交過夜。洗膜后與1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育2 h，ECL 化學發光系統檢測反應產物信號，采用Gbox-chemiHR-E電泳成像分析系統拍照并計算蛋白條帶的光密度值。同樣步驟進行內參GAPDH(sc-48166)測定，每個樣本重復3次取平均值，目標蛋白的相對表達量以其與內參GAPDH的光密度相對比值表示。

2 結果

2.1 異氟醚對乙酰膽堿誘導的ERK1/2的磷酸化水平的影響 與對照組比較，單純異氟醚處理對PC12細胞中ERK1/2磷酸化水平沒有明顯影響，而單純ACh刺激可導致ERK1/2磷酸化水平顯著增加(P<0.01)，但異氟醚處理可明顯阻礙ACh 升高ERK1/2磷酸化的效應(P<0.01)。這種干擾作用持續存在，異氟醚處理1 h后，PC12細胞中ERK1/2磷酸化水平仍然明顯低于單純ACh刺激組(P<0.01)。至異氟醚處理3 h后，兩組細胞中ERK1/2磷酸化水平沒有明顯差異。

2.2 異氟醚對乙酰膽堿誘導的蛋白酶B的活性的影響 單純ACh刺激對PKB磷酸化水平沒有明顯影響。與之相反，異氟醚處理可明顯增加PC12細胞中基礎狀態下PKB的磷酸化水平(P<0.05)，異氟醚和乙酰膽堿共同處理導致PKB磷酸化水平達峰值(P<0.05)。異氟醚處理1 h后，PC12細胞中PKB的磷酸化水平略高于對照組，但差異無統計學意義(P=0.082)。異氟醚處理3 h，后PKB磷酸化完全恢復正常水平。

3 討論

術后認知功能障礙是術后常見的并發癥，主要表現為幻視、幻聽、情緒狀態的改變和學習記憶功能的下降。術后認知功能障礙發病率較高，其影響因素眾多，確切發病機制目前尚不清楚，可能與年齡、手術應激及麻醉藥等相關。異氟醚是全身麻醉的主要用藥之一，在臨床工作中廣泛使用。流行病學調查發現，異氟醚能夠導致術后認知功能障礙的發生率增加，是后者的獨立危險因素之一[7-8]。基于動物模型研究也證實，異氟醚等吸入麻醉藥物能夠影響實驗動物的學習記憶功能，降低大鼠的認知能力，機理可能與麻醉藥改變了中樞神經系統的蛋白表達相關[9-10]。

圖2 PC12細胞中ACh刺激對PKB活性的影響以及異氟醚處理的協同效應

乙酰膽堿是中樞神經系統內重要的神經遞質，參與意識活動、學習記憶等多種復雜功能[11]。Fernandes 等[12]發現，ACh受體缺陷的小鼠存在學習、記憶等認知能力低下的現象。膽堿能系統阻滯同樣引起人類記憶、學習功能減退，臨床表現為進行性認知障礙和記憶力損害為主的阿爾茨海默病與膽堿能系統活性下降密切相關[13]。乙酰膽堿受體廣泛存在于神經系統中，與大腦的認知功能密切相關。G蛋白偶聯的mAChRs 可以激活一系列信號通路，包括RAS-ERK通路，除了調控細胞增殖和分化，該通路的激酶ERK1/2在成熟的神經元中也大量富集，參與調節突觸和神經元的結構和功能可塑性及學習和長時程記憶形成。RAS-ERK信號通路損壞的小鼠在水迷宮訓練中喪失記憶水下平臺的能力[14]。

研究表明，乙酰膽堿在中樞的傳遞可能是吸入性麻醉藥的作用靶點之一，多種吸入性麻醉藥可以強烈而可逆地抑制神經元中的乙酰膽堿受體，可能由此產生失憶效應[15]。本研究以高分化的褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞為基礎，研究異氟醚是否干擾神經細胞內神經遞質乙酰膽堿對信號通路關鍵激酶的誘導效應。結果顯示，單純乙酰膽堿刺激可快速增加神經樣細胞中ERK1/2的磷酸化水平，單純異氟醚處理對ERK信號通路沒有影響，但是異氟醚可以作用于乙酰膽堿受體，從而阻斷乙酰膽堿對ERK信號通路的刺激作用。這種阻斷效應在終止異氟醚處理后，仍可持續1 h以上，分析可能是細胞結構中少量殘留的脂溶性異氟醚即足以阻斷乙酰膽堿的作用。異氟醚雖然自身對ERK1/2的活性沒有影響，但可明顯增加PKB的磷酸化水平，與以往的報道相一致[16]。但與對ERK的間接影響效應相比較，這種刺激效應很短暫，說明神經元樣細胞內不同的信號通路對異氟醚處理的效應濃度和效應時程也不相同，提示在麻醉術后體內殘留的異氟醚可能主要通過干擾乙酰膽堿相關的ERK信號通路，從而影響認知功能。

總之，本實驗在體外研究初步證實異氟醚可以長時程減弱乙酰膽堿誘導的蛋白激酶活化，從而干擾胞內信號傳遞，這可能與術后認知功能障礙發生密切相關。未來有必要采用動物模型進一步研究異氟醚對膽堿能神經元的胞內信號通路的影響，探討麻醉后認知功能障礙發生的分子機制。

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