兩種前列腺癌細胞株中E鈣粘素和波形蛋白的表達意義

黃 勇，閆 駿,朱小軍

0 引言

前列腺癌容易發生骨轉移，一般來講，患者前去就診之時，已有近一半的患者發生了骨轉移[1-3]。從臨床經驗上看，前列腺癌患者出現骨轉移是一個重要的臨床特征，說明患者的死亡率將大幅度升高[4]。但是，目前前列腺癌發生骨轉移的相關機制尚不明了，對于癌細胞發生轉移來講，其脫離原發病灶，繼而增強自身運動能力是前列腺癌細胞完成轉移的關鍵[5]。因此，在臨床上鑒定E鈣粘素和波動蛋白這兩種蛋白是研究前列腺癌發生骨轉移機制的重要手段,而這兩種蛋白出現于LNCaP和IA8這兩種細胞株中，其中E鈣粘素與腫瘤關系十分密切，其下降時，會造成細胞間的粘附力下降，最終細胞脫落，尤其在前列腺癌、肺癌及胃癌中，E-鈣粘素的下降，其腫瘤發生轉移要高于其他腫瘤，且相關研究證實，E-鈣粘素的缺失，在前列腺癌細胞株中的表現較為明顯，可見其參與了細胞的轉移和侵襲。而波形蛋白，其在浸潤和轉移中，會影響細胞骨架及細胞的生物學行為，它也是中間纖維的主要成分之一，所以，檢測為E鈣粘素和波形蛋白，對于臨床治療分期及藥物療效評估具有重要的意義。筆者從實驗的角度對前列腺癌LNCaP和IA8兩種細胞株中的E鈣粘素以及波形蛋白的表達情況使用Western印跡法進行鑒定，分析了不同轉移潛能以及在前列腺癌轉移過程中的作用機制，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗細胞株：LNCaP和IA8。抗體及試劑：兔抗人多克隆E鈣粘素抗體，鼠抗人單克隆波形蛋白抗體，鼠抗人單克隆β-肌動蛋白抗體，羊抗鼠和羊抗兔均進行堿性磷酸酶標記。顯色試劑盒采用NBT/BCIP試劑盒。培養液使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液。1%的NP-40細胞裂解液：1%NP-40，150 mmol/L的NaCL，50 mmol/L的Tris，0.1%的SDS，200 μg/mL的PMSF，0.5%的脫氧膽鹽酸，50 μg/mL的抑肽酶，pH=7.4,考馬斯亮藍G-250。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 使用RPMI 1640培養液在含5%二氧化碳，溫度為37 ℃的孵化箱中進行培養。消化傳代混合液使用1.25 g/L胰酶+0.2 g/L的EDTA。經過胰酶消化和PBS沖洗液漂洗后，將標本轉移到1.5 mL的Eppend rof管內。然后使用1% NP-40細胞裂解液對細胞進行裂解，劇烈震蕩后將細胞充分懸浮混合均勻，靜置于4 ℃的環境中0.5 h，然后使用離心機離心10 min，離心率為15 000 r/min，然后提取上清液總蛋白。經考馬斯亮藍G-250定量之后，放入100 ℃沸水中煮10 min進行變性。

1.2.2 Western印跡法 鑒定方法：選擇Western印跡法，每孔樣品為30 μg，使用10%的SDS-PAGE凝膠于80 V電壓之下進行分離，然后將電壓調低至25 V，待SDS-PAGE凝膠上的蛋白半干后轉移至NC膜上，然后使用5%的脫脂奶粉將NC膜封閉，2 h之后，加入稀釋度為1∶100的兔抗人多克隆E鈣粘素抗體，鼠抗人單克隆的波動蛋白抗體，以及鼠抗人單克隆的β-肌動蛋白抗體。在4 ℃的孵化箱中孵化過夜，然后使用TPBS進行充分漂洗后，加入經過堿性磷酸酶標記的稀釋度為1∶500的羊抗兔IgG和稀釋度為1∶200的羊抗鼠IgG，在孵化箱中孵化2 h后，使用NBT/BCIP試劑盒進行顯色，再使用圖像分析儀進行NBT/BCIP試劑盒顯色的條帶進行灰度分析。

2 結果

經過分析顯示，E鈣粘素在LNCaP中存在高表達，在IA8中卻缺失(圖1)，而波形蛋白卻在IA8中存在高表達，在LNCaP中缺失(圖2)，可見E鈣粘素和波形蛋白在LNCaP和IA8細胞表達中差異有統計學意義(P<0.01)，而β-肌動蛋白在二者的表達中差異無統計學意義(P>0.05)，但二者的E鈣粘素/β-肌動蛋白及波動蛋白/β-肌動蛋白差異有統計學意義(P<0.01)，具體見表1。

表1 LNCaP和IA8細胞株中的E鈣粘素、波形蛋白和β-肌動蛋白表達對比

圖1 E鈣粘素在LNCap以及IA8中的電泳結果

圖2 波形蛋白在LNCap以及IA8中的電泳結果

3 討論

前列腺癌容易發生骨轉移，臨床前列腺癌的前期診斷不易，因此，一般患者前去就診之時，已經有30%～50%的患者發生了骨轉移[6]。前列腺腫瘤的轉移是一個非常復雜的過程，同時也是一個有序的過程。在整個的前列腺腫瘤轉移過程中，腫瘤存在著粘附性大幅度下降，基質大部分降解和癌細胞的遷移性大幅度增強的臨床特征[7]。根據一般的臨床經驗，如果前列腺癌患者發生骨轉移就是一個非常重要的標志性臨床特征，說明至此之后患者的死亡率將大幅度提高[8]。這是因為前列腺癌細胞之間的粘附性大幅度下降之后，癌細胞的自身運動能力得到了大幅度的增強，從而使癌細胞有可能脫離本來的原發病灶，對周圍的組織進行浸潤，繼而向遠處轉移[9]。一旦患者的前列腺癌細胞發生大規模的轉移，其必然會導致患者的全身細胞受到威脅，最終患者的死亡率將升高。

但是，目前對前列腺癌發生骨轉移的相關機制還不十分清楚。對于癌細胞發生轉移，從上文的分析來看，癌細胞脫離原發病灶，繼而增強自身運動能力是前列腺癌細胞完成轉移的關鍵條件。在前列腺癌細胞轉移的過程中，E鈣粘素和波動蛋白發揮了非常重要的作用。因此，在臨床上鑒定E鈣粘素和波動蛋白這兩種蛋白實現研究前列腺癌發展骨轉移機制的重要手段。然而，這兩種蛋白主要存在于LNCaP和IA8這兩種細胞株中[10]。

E鈣粘素是鈣粘素家族中重要的一員,鈣粘素是一系列具有相似結構和功能的單鏈跨膜糖蛋白族[11]。根據這些鈣粘素本身的來源進行區分，可以分為神經型鈣粘素(N)、上皮型鈣粘素(E)和胎盤型鈣粘素(P)3種。鈣粘素構成細胞主要依賴于其本身的粘附性，其可以作為受體，對維持細胞之間的黏附和保持細胞的完整性有重要作用。但是，在三種類型的鈣粘素中，E鈣粘素主要參與了前列腺癌細胞的轉移，如果E鈣粘素的表達降低，細胞之間的粘附性必然會大幅度下降，從而導致了細胞的病變性脫落。其實，不僅僅是前列腺癌，在其他的諸如肺癌、頭部腫瘤、胃癌等惡性腫瘤中，E鈣粘素的低表達都提示了癌細胞存在轉移的特征。從研究文獻的結論上看，已經有大量的研究表明，E鈣粘素的表達與上皮型的腫瘤轉移有著非常密切的關系。進一步的研究表明，E鈣粘素表達的下降，甚至是缺失是與前列腺癌的轉移程度和能力之間存在著負相關關系[11-12]。

然而，要完成前列腺癌細胞的轉移，細胞的粘附性下降，最終脫落只是第一步，關鍵性的一步是細胞脫落之后運動能力增強。與此密切相關的是中間纖維，其中波動蛋白就是其非常重要的一種中間纖維。其主要分布于上皮細胞、肌細胞、神經元細胞、神經膠質細胞中，其與前列腺癌細胞的生長，分化，游走，遷移有著很大的關系。根據以往的研究結果，異常的波動蛋白表達容易導致細胞骨架蛋白的質量發生根本性改變，使得細胞骨架蛋白發生結構性的改變，上皮細胞由原來的立方型轉變為紡錘纖維型，使得細胞更容易發生游走遷移，同時作為細胞內部信息傳遞載體的細胞骨架蛋白排列發生了結構性改變，嚴重干擾了細胞骨架與胞外基質的跨膜反應，使得粘著斑、微絲及膜受體之間的活性狀態發生了失控，不能調節細胞的運動和黏附，促進了細胞解體和脫落，游走遷移。而相關研究得出，細胞內外信號是通過細胞骨架進行傳遞的，其是一個有效載體，在正常狀態下，胞膜與細胞骨架是相連的，且與細胞外的基質有跨膜反應，其可以控制粘著斑以及微絲和膜受體的活性，從而進一步調節細胞的粘附與運動，而波形蛋白的異常表達，則可造成骨架系統排列出現變化，進一步對信號的傳導產生干擾，促成了細胞生物學性狀的改變[13-15]。本研究中，在IA8這種高轉移細胞株中，波形蛋白的表達要顯著高于LNCaP，從而再次證實了波形蛋白的上調，可以作為前列腺癌細胞轉移能力的一種體現，可促進其轉移，因此，可以通過這兩個蛋白，檢測癌癥發展進程，對于指導用藥及判斷藥物療效具有重要的意義。

總之，前列腺癌患者的LNCaP和IA8細胞株中確實存在著E鈣粘素和波形蛋白表達差異，說明E鈣粘素和波形蛋白在前列腺癌的轉移過程中發揮著重要促進或者抑制作用，這對探討前列腺癌細胞骨轉移的機制并最終對抗前列腺癌有重要意義。

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