卵子玻璃化冷凍在體外受精－胚胎移植取精失敗周期中的應用

耿 潔，胡玉琴，劉蘭蘭

(1.中國人民解放軍第174醫院生殖中心，福建 廈門 361000;2.安徽醫科大學，安徽 合肥 230000)

隨著玻璃化冷凍技術的臨床應用，卵子冷凍技術獲得了很大的進展，甚至可以得到與新鮮卵子相同的妊娠率［1］，這樣，可以通過卵子的冷凍保存來解決體外受精－胚胎移植(IVF－ET)中因男方因素無法獲得精子的問題。本文分析2010年8月至2012年8月，在我院生殖醫學中心取卵日取精失敗接受卵子冷凍－解凍的5例患者的臨床結局，探討卵子玻璃化冷凍技術在取精失敗周期中應用的可行性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 自2010年起我院生殖醫學中心對進行IVF－ET治療中，因取卵日無法獲得精子的卵子進行玻璃化冷凍。知情同意書經倫理委員會討論并通過。5例患者的玻璃化冷凍保存的卵子解凍后進行了顯微授精(ICSI)治療。平均年齡35.4歲，不育時間平均5.8年。均因男方因素取卵日無法獲得精子進行全部的卵子冷凍保存。

1.2 卵子凍融方法 冷凍液分為平衡液和冷凍液，4℃保存，使用前取出室溫(25℃)平衡30 min。將卵子置于ES表面，室溫下放置，卵子自然下沉，出現皺縮再回復，當卵子膨大到最大程度時(至少回復80%)，迅速用巴氏吸管取出卵子。整個過程大約5 min，一般不超過15 min;然后將其放入VS，在VS中3個不同的位置用吸管進行吸放，時間不超過30～60 s，將卵子以最小液滴體積轉移至玻璃化冷凍載體上，迅速置入液氮中，標記保存。卵子的復蘇液分為1、2、3、4，均由我生殖中心實驗室配制。使用前，1在37℃平衡30 min，其他解凍液室溫(25℃)平衡30 min。將載體Crytop從液氮中取出，迅速將前端葉片浸入1中，1 min內卵子脫落到1中。將卵子轉移至2內，放置3 min，卵細胞部分恢復至冷凍前形態，但仍未恢復至冷凍前形態。再將卵子依次置于3和4中各5 min，卵子形態將完全恢復，然后轉入培養液中培養。對所有解凍后的卵子均采用ICSI方式進行授精。

2 結果

5例患者均解凍了取卵日實施全部冷凍保存的卵子。共復蘇卵子 35枚，存活 24枚，復蘇率68.57%;有24枚MⅡ卵子行ICSI，受精22枚，受精率91.67%;形成19枚胚胎，卵裂率86.36%，獲可用胚胎16枚。5個移植周期移植胚胎13枚，臨床妊娠 2例，分娩 2個健康嬰兒，胚胎種植率15.38%，活產率40%。剩余冷凍胚胎3枚。

3 討論

玻璃化冷凍技術是一門新興技術，其基本原理是細胞及其保護劑溶液以足夠快的降溫速率，由液態轉化為外形類似玻璃狀的非晶體化固體狀態，由于玻璃化液在低溫時黏稠度變得很高而不結晶，形成形態不規則的玻璃樣固體，并保留了細胞內外液體正常的分子和離子分布，從而避免產生冷凍損傷［2］。細胞在冷凍過程中容易形成冰晶，損傷細胞膜及細胞內結構，對細胞造成致命的傷害，而玻璃化冷凍就可以很好地解決這一問題。

隨著1998年首次用玻璃化冷凍人類胚胎并獲成功妊娠，玻璃化冷凍被廣泛應用于胚胎及卵子的冷凍。卵子冷凍為女性患者保存生育力提供了最大希望，也為臨床特殊病例提供了保障。目前卵子玻璃化冷凍保存技術被認可，近年在臨床上也開始逐步應用。Cobo等［3］對照分析研究了2005～2009年的4282枚玻璃化冷凍卵子、3524枚新鮮卵子和361枚慢速冷凍的卵子，結果顯示玻璃化冷凍復蘇卵子在受精率、胚胎形成率及妊娠率與新鮮卵子相似，比慢速冷凍的卵子生存率及受精率高。Smith等［4］通過前瞻性對照研究發現玻璃化冷凍與程序化冷凍比較，復蘇率、臨床妊娠率有顯著的差異。穩定成熟的卵子冷凍技術是臨床應用的前提，本中心只獲得了68.57%的復蘇率，可能與經驗不足有關，但是獲得了一定的妊娠率，避免了過去因取卵日取精失敗而丟棄卵子的現象。

近年卵子玻璃化冷凍應用取得了顯著成效，但技術的有效性仍需評價，尤其是高濃度冷凍保護劑的影響和標本直接與液氮接觸帶來的污染問題，還有冷凍技術本身帶來的一定遺傳風險都決定今后研究方向應為冷凍方法的優化與安全性。對936例［5］通過卵子冷凍保存出生的嬰兒調查顯示，其中392例玻璃化冷凍，532例通過慢速冷凍，均未增加出生缺陷風險。Wennerholm等［6］發現玻璃化冷凍卵子出生的221例孩童與正常出生體重無差異。有限的資料提示是安全的，但還需要進一步的研究［7］。從我們目前的初步研究來看，卵子的玻璃化冷凍保存可以獲得一定的臨床妊娠率［8］，對IVF－ET治療中取精失敗患者可以作為臨床治療的一個供選擇的方法。

［1］ Cil AP，Seli E.Current trends and progress in clinical applications of oocyte cryopreservation［J］.Curr Opin Obstet Gynecol，2013，25(3):247－254.

［2］ Tao T，Del Valle A.Human oocyte and ovarian tissue cryopreservation and its application［J］.J Assist Reprod Genet，2008，25(7):287－296.

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［4］ Smith GD，Serafini PC，Fioravanti J，et al.Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow－rate freezing or vitrification［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2088－2095.

［5］ Noyes N，Porcu E，Borini A.Over 900 oocyte cryopreservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies［J］.Reprod Biomed Online，2009，18(6):769－776.

［6］ Wennerholm UB，Sderstrm－Anttila V，Bergh C，et al.Children born after cryopreservation of embryos or oocytes:A systematic review of outcome data［J］.Hum Reprod，2009，24(9):2158－2172.

［7］ Noyes N，Reh A，McCaffrey C，et al.Impact of developmental stage at cryopreservation and transfer on clinical outcome of frozen embryo cycles［J］.Reprod Biomed Online，2009，19(Suppl 3):9－15.

［8］ 賀貞，朱明輝，楊丹.不同來源精子行體外受精/卵胞漿內單精子顯微注射所得胚胎凍融及移植后妊娠結局比較［J］.實用醫院臨床雜志，2010，7(1):41－43.