頭孢菌素C高產低耗發(fā)酵菌株的選育

袁曉明 李素榮（石藥莊 石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司）

近年來，隨著社會對環(huán)境的重視，作為排放危險廢棄物（廢菌絲）的行業(yè)，越來越受到制約，同時，市場競爭也愈演愈烈，使各大廠家不得不盡量降低生產成本。我們建立快速測定發(fā)酵液中頭孢菌素C的方法，初步確定篩選高產低耗菌株的最佳方法，為頭孢發(fā)酵生產實際提高檢測速度和菌株篩選方法的優(yōu)化提供新的思路。

一、快速測定頭孢菌素C的方法

頭孢菌素C的檢測方法有多種：碘量法、260 n m縈外分光法、生物測定法、高壓液相法等。在這些方法中都較慢，難以快速的處理較大數(shù)量的樣品。因此，不能直接的用于高通量方法中的檢測。我們通過多次試驗，對碘量法進行改良，使其能夠快速的檢測顯色，用于通量菌種選育。

1.碘量法的原理

完整的頭孢菌素分子不能與碘起作用，若用堿將頭孢菌素分子的內酰胺環(huán)破壞而生成青霉噻唑酸，就能與碘起作用，加入一定量的碘，其中一部分碘與頭孢菌素噻唑酸起作用，剩余的碘則用硫代硫酸鈉滴定，從頭孢菌素的消耗碘量，便可算出效價。碘與青霉噻唑酸在一定條件下（p H 4.4-4.5，溫度25℃）一分子頭孢菌素破壞成的青霉噻唑酸，能與8個碘原子起作用。

2.實驗試劑和儀器

試劑：硫代硫酸鈉（0.01077 mo l/L）、鹽酸（1mo l/L）、氫氧化鈉（1mo l/L）、碘液（0.005mo l/L）、醋酸鈉緩沖液（p H=4.4～4.5）、可溶性淀粉(0.5%)

儀器：碘量瓶（100 mL）、容量瓶（100 mL、150 mL 、200 mL、250 mL）、取樣槍（0.01mL、0.1mL、1mL）、自制加碘裝置（20 mL酸式滴定管25mL堿式滴定管25mL

3.實驗方法

精密稱取定量頭孢類抗生素產品，采用不同的稀釋倍數(shù)，液相色譜儀進行定量檢測，計算頭孢類抗生素發(fā)酵單位或效價，記錄結果。用已知效價的稀釋液，采用間接碘量法進行測定，用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）標準液進行滴定，記錄已知效價的稀釋液消耗碘液量。建立限量檢測方法，用淀粉做指示劑。

我們吸取定量的稀釋液，加入一定量的碘液，加入3-4滴淀粉指示劑，如果顯色，效價低于已知效價，如果不顯色，效價等于或大于已知效價

二、高產低耗菌株的優(yōu)選工

1.實驗材料和設備

菌種：頂頭孢霉菌(Cephalosporium acr—emonium)RR9

培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基（斜面、分離平板）p H7.0±0.2

液培培養(yǎng)基：（g/L）：麥芽汁24.0、麥芽糖40.0、蛋白胨10.0

菌種選育誘變劑、融合劑：15W紫光燈、1%氯化鋰、30%的聚乙二醇

菌種保護劑：20%的甘油

實驗設備：誘變箱、SPY-50上海搖床、高壓液相

2.實驗方法

（1）原生質體制備

取培養(yǎng)至節(jié)孢子成熟期的茄子瓶斜面，加無菌水10 mL，取其中1mL接種于500 mL的三角瓶中，溫度25℃、濕度50%、搖床轉速110 r/轉，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（36小時左右）使用纖維素酶。蝸牛酶處理。

（2）紫外誘變、氯化鋰處理

制備頂頭孢霉菌的原生質體,使原生質體的含量為106-107個/mL，照射距離為15c m。取照射過的原生質體懸液進行梯度稀釋、涂布 梯度平板、恒溫培養(yǎng)，同時以未經處理的孢子液作為對照。同樣方法，進行1%氯化鋰處理。

（3）低溶氧菌株的篩選

選擇形態(tài)豐滿、色澤及大小適中的菌落，分別編號，制作冷凍管，保存于-80℃冰箱中。同時，按配方配制種子瓶，按常規(guī)方法進行接種、培養(yǎng)。配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將搖床轉速調整由280 r/mi n調整為120 r/mi n震蕩培養(yǎng)，以篩選出低溶氧菌株。

（4）廢菌絲水利用菌株的篩選

選擇形態(tài)豐滿、色澤及大小適中的菌落，分別編號，制作冷凍管，保存于-80℃冰箱中。同時，按配方配制種子瓶，按常規(guī)方法進行接種、培養(yǎng)。配制發(fā)酵培養(yǎng)基，用發(fā)酵液過濾末端的菌絲水（超濾膜過濾）替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米漿、花生餅粉、谷朊粉等物質，以篩選出低菌絲水回收利用菌株。

（5）融合及低溶氧、菌絲水回收利用菌株的篩選

將所得幾株低溶氧條件下(轉速由280 r/mi n調整為120 r/mi n)的高單位菌株、廢菌絲水替代菌株及出發(fā)菌株在30℃溫控下，用30%PEG處理，涂平板、恒溫培養(yǎng)。從中篩選即低溶氧又回收利用廢菌絲水的菌株。

小結

1.由于快速顯色檢測效價方法的建立，使得菌種選育速度得到很大的提高，搖床處理搖瓶最多100個，而處理離心管可達5000支以上。使用高壓液相測定菌株培養(yǎng)液效價，每支樣品需要6分鐘，而使用改良的碘量法顯色測定40支的培養(yǎng)液效價（使用排槍取用樣品），一共需要30分鐘即可。

2.篩選出低消耗、回收利用廢菌絲水的菌株。通過以上實驗得到低溶氧且回收利用菌絲水的菌絲D J-228，其相對于出發(fā)菌株R R 9，在發(fā)酵單位及質量指標持平的情況下，溶氧消耗（電能節(jié)約）降低50%以上，過濾崗位以2-3倍沖水比情況下的末端菌絲水可替代基礎料中的玉米漿20%以上。