氟尿嘧啶通過激活促凋亡信號通路介導人肝癌細胞凋亡的治療作用

任召磊

0 引言

肝癌是侵入性肝臟的惡性腫瘤之一，且多見于原發性肝癌[1]。當前我國肝癌發病率居高，已嚴重威脅到人民健康和生命安全，造成了沉重的社會負擔，其誘發的并發癥也難以控制[2]。目前，臨床上多采用手術切除腫瘤組織，達到清除腫瘤細胞的效果，但其突顯的風險高，費用高，預后差等特性也限制了它的推廣[3]。而化學治療是治療腫瘤等疾病的主要手段之一，氟尿嘧啶對多種腫瘤如肝癌等有一定療效，故在臨床上得到廣泛應用[4]。在當前的實驗中，我們擬采用體外建立穩定人肝癌HepG-2細胞株，以細胞凋亡為研究對象，研究氟尿嘧啶的抗肝癌作用與促凋亡相關通路關系，為闡明其誘導HepG-2凋亡的作用機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌HepG-2細胞株由廣西醫科大學附屬腫瘤醫院科學實驗室惠贈。

1.1.2 藥物與試劑 氟尿嘧啶(純度>99.0%)：Spectrum公司。DMEM培養基：Life Technologies公司。胎牛血清：上海微科生化試劑有限公司。胰蛋白酶：Life Technologies公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)：上海杰美基因醫藥科技有限公司。DAPI染色試劑盒：北京中生瑞泰科技有限公司。Fas和cleaved-caspase-8抗體：Life Technologies公司。蛋白裂解液：武漢博士德生物工程有限公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：Life Technologies公司。

1.1.3 儀器HettCube 200二氧化碳培養箱(德國Hettich公司)。XYH-3A倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。HD-650超凈工作臺(上海皓莊儀器有限公司)。Biorad GelDoc XR伯樂凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。SHP-250(D)恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 無菌條件下，BD培養基中加入新配置10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素，低溫保存待用。HepG-2細胞經復蘇后，移植到培養瓶中，放置于二氧化碳培養箱中孵化(37 ℃，5% CO2)。PBS緩存液沖洗5次，加入8 mL 0.2%的胰蛋白酶液，置37 ℃消化15 min。隨后，細胞懸浮液移入無菌刻度離心管中，低速離心15 min后再次消化5次，然后進行MTT實驗操作。

1.2.2 分組及給藥 精密稱取200 μg氟尿嘧啶，用含10%胎牛血清的BD培養基稀釋成不同濃度的5-Fu(0、40、80、160 μM)，每孔120 μL，同時設8個平行孔/組，重復實驗10次，取平均值。應用GraphPad Prism 5.0軟件計算IC50(半數抑制率)，同時建立對照組。細胞增殖抑制率(%)=(OD對照-OD治療)/(OD對照-OD空白)×100%

1.3 指標檢測 采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定5-Fu對HepG-2的抑制作用，DAPI染色檢查細胞形態學的改變，Western blot法測定內源性Fas蛋白以及cleaved-caspase-8表達水平。

P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5-Fu干預抑制HepG-2增殖 MTT法實驗數據表明，梯度濃度5-Fu抑制HepG-2的增殖活力明顯增強，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。而且，隨著時間的增加5-Fu的抑制作用逐漸增加，體現一定的時間-劑量依賴性。見圖1。

圖1 5-Fu干預對HepG-2抑制增殖的作用

2.2 5-Fu干預誘導HepG-2細胞核裂變 DAPI染色結果顯示，空白對照組中HepG-2的細胞排列均勻，組織形態整齊完整，胞核漿清晰，細胞增殖分化旺盛。40 μM 5-Fu干預72 h后，部分肝癌細胞體積收縮，細胞質變性明顯，核破裂，表現細胞凋亡。同時，在80和160 μM 5-Fu干預后，HepG-2核染凋亡細胞明顯增多，細胞凋亡形態改變明顯，核裂解溶解，凋亡細胞數量增加。見圖2。

圖2 5-Fu干預后對HepG-2細胞組織形態的影響(DAPI染色，×200)

2.3 5-Fu干預上調HepG-2內源性Fas、cleaved-caspase-8表達 Western blotting分析數據表明，空白對照組HepG-2細胞內源性Fas、cleaved-caspase-8表達較少，基本維持在低生理水平狀態。而在5-Fu干預后，HepG-2細胞Fas蛋白和cleaved-caspase-8表達水平顯著增加，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)，表現為一定的時間-劑量依賴性。見圖3。

圖3 5-Fu干預后對HepG-2細胞Fas蛋白和cleaved-caspase-8表達水平的影響

3 討論

肝癌是一種嚴重威脅全球公眾健康的疾病之一，且患者生存率低[5]。因此，鑒定具有更好的效力和較低的毒性的抗肝癌藥物是迫切需求的科學攻關[6]。在當前實驗中，MTT法數據顯示，正常情況下HepG-2細胞增殖分化能力強，提示抑制癌癥細胞過度增殖是治療肝癌的有效手段。5-Fu干預后能有效控制HepG-2增殖分化，表明5-Fu發揮有效的抑制肝癌細胞增殖活性。而且，DAPI染色形態檢查進一步顯示，5-Fu可以介導HepG-2細胞核裂變，即發生細胞凋亡，其實驗結果與MTT結果一致。

研究表明，細胞內Fas元件耦合其配體FasL介導細胞的殺傷作用，其機制為通過穿孔素和顆粒酶相互作用的結果。穿孔素在大量的Ca2+微環境中直接作用在靶細胞膜，并經多聚反應形成管狀結構，直接插入并破壞細胞膜結構，同時顆粒酶轉移至胞漿，直接招募活化胞漿中系列蛋白酶，誘導細胞發生程序性凋亡[7-8]。半胱氨酸蛋白酶caspase-8因具有FADD樣結構域，而且與DED結構域結合，從而將細胞膜外信號轉化為細胞漿內在聯系。當細胞膜表面的Fas與其配體FasL多聚化而激活時，觸發FADD與受體胞漿區死亡結構域互相結合，胞漿中變構后(剪切)caspase-8，使下游蛋白酶發生逐級活化，從而啟動細胞內交聯的細胞凋亡進程[9-10]。因此，癌細胞內源性Fas/caspase-8通路是抗腫瘤藥物開發的潛在靶點。本實驗Western blotting結果表明，HepG-2細胞內源性Fas蛋白和cleaved-caspase-8水平顯著減少。在5-Fu干預后，HepG-2細胞中Fas蛋白和cleaved-caspase-8水平有效地上調，表明5-Fu特異性激活Fas蛋白活性，從而增強caspase-8剪切水平，進而啟動系列程序誘導靶細胞發生凋亡。我們推測5-Fu介導的抗肝癌作用與其激活HepG-2內源性Fas信號通路有關，并將為其今后的臨床應用提供科學理論支持。

參考文獻：

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