抗血管性血友病因子抗體對特發性血栓性血小板減少性紫癜的影響

覃乃輝，裴正玲，周達利，秦 立，黃慧嬪

（1.廣西壯族自治區人民醫院檢驗科，南寧 530021；2.廣西壯族自治區南寧市第一人民醫院檢驗科 530022）

血栓性血小板減少性紫癜（TTP）是一種罕見的血栓性疾病，其特點是播散性微血管血栓形成導致的血小板減少和微血管性溶血性貧血［1］，并可引起患者多器官功能障礙而嚴重危及患者的生命。TTP是臨床的罕見病，臨床上通常根據發病機制分為遺傳性、繼發性和特發性3種類型，其中，特發性TTP是臨床上最常見的類型［2－3］。有研究發現，TTP患者血漿中存在超大分子量的血管性血友病因子（vWF）多聚體，在發病過程中起到至關重要的作用［4］。而以往研究表明，大多數特發性TTP患者vWF多聚體的形成是由于患者血漿中存在抗血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）自身抗體［5－6］。近年來，有學者發現部分特發性TTP患者存在抗血管性血友病因子（vWF）抗體，可能在發病中起到重要的作用［7］。為探討vWF抗體在特發性TTP發病中的意義，作者進行了相關研究，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇廣西壯族自治區人民醫院2010年1月至2013年6月收治的特發性TTP患者28例，平均（24.8±7.8）歲；另選同期門診體檢的健康者30例作為健康對照組，平均（25.6±7.2）歲，所有參與研究的人員均對研究知情同意，并經醫院倫理委員會審批。

1.2 方法 所有受試者采集外周靜脈血5mL，注入枸櫞酸鈉抗凝，3000r／min離心10min，分離血漿，置于－70℃低溫保存集中檢測。應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測受試者血漿ADAMTS13抗原水平，由廣西醫科大學腫瘤學重點實驗室檢測，具體方法：應用抗ADAMTS13單克隆抗體2G3（4μg／mL）（試劑盒購自丹麥Dako公司）包被96孔板，4℃過夜，采集50μL患者血漿按1∶4，1∶8，1∶16稀釋，加入待測孔，37℃孵育1h，滴加ADAMTS13單克隆抗體作為一抗，室溫孵育1h，加入生物學二抗，辣根過氧化酶GAMHRP（Sigma公司生產）標記，室溫孵育1h，應用鄰苯二胺顯色，1.5mol／L硫酸終止反應，490nm酶標儀讀取吸光度值。如待檢混合血漿中ADAMTS13活性較正常血漿的混合血漿ADAMTS13活性下降50%以上，表示待檢血漿中存在抑制物。vWF抗體檢測采用ELISA法（試劑盒購自丹麥Dako公司），酶標儀讀取490nm條件下反應物吸光度A值，如檢測值高于x±2s則判定為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TTP患者vWF抗體檢測結果 28例特發性TTP患者中有3例患者vWF抗體陽性（vWF抗體陽性組），其余患者vWF抗體陰性（vWF抗體陰性組）。vWF抗體陽性組ADAMTS13抗體均為陰性，ADAMTS13含量均低于正常值，見表1。

表1 3例vWF抗體陽性TTP患者檢測結果

2.2 3組ADAMTS13抗原和vWF抗體檢測情況 將所有受試者檢測結果分析，vWF抗體陽性組（3例，4份血漿）血漿ADAMTS13含量為（73.88±35.52）mU／mL，vWF抗體陰性組（25例，32份血漿）血漿 ADAMTS13含量為（102.71±38.66）mU／mL，健康對照組（30例，30份血漿）血漿 ADAMTS13含量為（528.78±185.66）mU／mL，vWF抗體陽性組血漿ADAMTS13含量明顯低于vWF抗體陰性組和健康對照組，3組血漿ADAMTS13含量差異有統計學意義（P＜0.01）。vWF抗體陽性組患者血漿vWF抗體A值明顯高于vWF抗體陰性組和健康對照組（P＜0.01），見表2。

2.3 28例特發性TTP血漿置換（PE）前后血漿ADAMTS13抗原和vWF抗體水平檢測 28例患者中23例采取PE治療，其中，17例經過2次PE治療，6例經過1次PE治療，PE治療后血漿ADAMTS13抗原明顯升高，vWF抗體A值明顯降低（P＜0.05），見表3。

表2 3組血漿ADAMTS13抗原和vWF抗體檢測情況

表3 28例特發性TTP PE前后ACMTS13抗原和vWF抗體水平

3 討 論

TTP是一種罕見的血栓性疾病，多年以來，臨床上診斷TTP主要依賴于“五聯征”和溶血、血栓等實驗指標，給其診斷和治療帶來了一定的困難［8］。直到1998年，Furlan等［9］研究發現TTP患者血漿中ADAMTS13活性嚴重缺乏，給TTP發病機制的研究帶來了新的方向。研究證實，TTP患者血漿ADAMTS13缺乏主要是由于患者ADAMTS13基因突變或抗ADAMTS13自身抗體引起［10］。目前，血漿ADAMTS13缺乏在TTP發病中的作用已經得到廣大學者的認同［11］。有報道表明，特發性TTP患者中血漿ADAMTS13活性嚴重缺乏的發生率為33%～100%，平均為75%［12］。然而，仍有1／4的TTP患者血漿ADAMTS13活性正常或僅輕度降低，而4%～62%的特發性TTP患者也未發現抗ADAMTS13自身抗體［13］。

近年來，有研究發現，TTP患者血漿中存在超大分子量的vWF多聚體，在發病過程中起到至關重要的作用［14］。而部分特發性TTP患者存在vWF抗體，可能在發病中起到重要的作用。Bonnefoy等［15］認為，TTP患者vWF抗體與vWF形成復合物，是誘導患者血小板自發性聚集的原因之一。本研究對28例特發性TTP患者血漿ADAMTS13和vWF相關指標進行了檢驗，結果發現3例TTP患者vWF抗體陽性。這3例患者血漿中均存在vWF多聚體，但抗ADAMTS13為陰性。vWF Ag、vWF CB和vWF Rcof均正常，基本可以排除獲得性血管性血友病。進一步分析發現，vWF抗體陽性組、vWF抗體陰性組血漿ADAMTS13含量均明顯低于健康對照組，證實了TTP患者血漿ADAMTS13活性嚴重缺乏。而vWF抗體陽性組血漿ADAMTS13含量明顯低于vWF抗體陰性組，提示vWF抗體可能對抗ADAMTS13活性，并參與vWF復合物的形成，在特發性TTP發病中起到重要的作用。

為進一步證實以上觀點，作者對28例患者PE前后血漿ADAMTS13抗原和vWF抗體水平進行了比較。從結果來看28例特發性TTP經過PE后ADAMTS13抗原明顯升高，vWF抗體A值明顯降低。目前，PE仍是TTP急性發作的主要治療方法，該方法可以顯著降低患者的病死率，延長患者生存時間。本實驗結果提示，通過PE治療后患者vWF抗體水平明顯降低，而血漿ADAMTS13含量得到提高，并可能進一步影響vWF復合物的形成，使疾病得到緩解。

［1］Jilma－Stohlawetz P，Gorczyca ME，Jilma B，et al.Inhibition of von willebrand factor by ARC1779in patients with acute thrombotic thrombocytopenic purpura［J］.Thromb Haemost，2011，105（3）：545－552.

［2］李忠俊，盧來春，滕本秀，等.血漿置換治療血栓性血小板減少性紫癜的臨床研究［J］.重慶醫學，2007，36（17）：1728－1743.

［3］王兆鉞.免疫性血小板減少性紫癜的發病機制與臨床研究進展［J］.中國免疫學雜志，2009，25（12）：1141－1144.

［4］Adamski J，Marques MB.Transfusion medicine illustrated.Massive hemolysis due to thrombotic thrombocytopenic purpura in a patient with AIDS［J］.Transfusion，2012，52（7）：1408－1409.

［5］Pos W，Sorvillo N，Fijnheer R，et al.Residues Arg568and Phe592contribute to an antigenic surface for anti－ADAMTS13antibodies in the spacer domain［J］.Haematologica，2011，96（11）：1670－1677.

［6］張敬宇，劉芳，馬珍妮，等.抗血管性血友病因子抗體在特發性血栓性血小板減少性紫癜發病機制中的作用［J］.中華檢驗醫學雜志，2012，35（12）：1118－1124.

［7］Zheng XL，Wu HM，Shang D，et al.Multiple domains of ADAMTS13are targeted by autoantibodies against ADAMTS13in patients with acquired idiopathic thrombotic thrombocytopenic purpura［J］.Haematologica，2010，95（9）：1555－1562.

［8］鄧明揚，張廣森，李斌，等.血栓性血小板減少性紫癜患者血管內皮細胞標志物和溶血參數的動態分析及其臨床意義［J］.中華血液學雜志，2005，26（3）：38－41.

［9］Furlan M，Robles R，Galbusera M，et al.von willebrand factor－cleaving protease in thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic－uremic syndrome［J］.N Engl J Med，1998，339（22）：1578－1584.

［10］Cataland SR，Jin M，Lin S，et al.Effect of prophylactic cyclosporine therapy on ADAMTS13biomarkers in patients with idiopathic thrombotic thrombocytopenic purpura［J］.Am J Hematol，2008，83（12）：911－915.

［11］季杰，劉霆，孟文彤，等.血管性血友病因子前肽及ADAMTS13水平在血栓性血小板減少性紫癜診斷中的價值［J］.四川大學學報：醫學版，2011，42（6）：807－810.

［12］尹亞飛，羅自勉，周新伏，等.血小板相關抗體在特發性血小板減少性紫癜診治中的臨床意義［J］.臨床醫學，2012，32（1）：4－5.

［13］何飛，梁昌達，潘曉芬，等.血小板相關抗體與兒童特發性血小板減少性紫癜轉歸的相關性分析［J］.中國小兒血液與腫瘤雜志，2011，16（5）：225－227.

［14］李恒渠，王登海，陳海飛，等.血栓性血小板減少性紫癜10例臨床分析［J］.檢驗醫學與臨床，2011，8（20）：2438－2439，2441.

［15］Bonnefoy A，Daenens K，Feys HB，et al.Thrombospondin－1 controls vascular platelet recruitment and thrombus adherence in mice by protecting（sub）endothelial VWF from cleavage by ADAMTS13［J］.Blood，2006，107（3）：955－964.