SHR大鼠左室肥厚與室性心律失常發生的相關性研究

黃 穎，伍偉鋒

（1.廣西壯族自治區民族醫院心血管內科二病區，廣西南寧 530001；2.廣西醫科大學第一附屬醫院心血管病研究所，廣西南寧 530021）

臨床研究已明確，約30%高血壓患者有左室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH），這類患者的心血管病病死率較無 LVH 的高血壓患者高8倍（16%vs.2%）［1－2］，一個十分重要的原因在于前者容易發生室性心律失常（ventricular arrhythmia，VA），但與之相關的基礎性研究較少，特別是有關SHR大鼠LVH與VA發生關系方面，目前尚無報道。Langendorff灌注是采用恒壓或恒流方式從主動脈根部逆向用含氧灌流液灌流，保持哺乳動物離體心臟存活從而對VA動物模型觀察心功能的方法，排除了神經、體液因素和心臟前后負荷等對實驗的影響。本研究旨在通過觀察SHR大鼠和對照大鼠的離體心臟在Langendorff灌注低鉀液時誘發VA的敏感性差異，從動物實驗角度為LVH在高血壓患者誘發VA中的作用做進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 主要材料 7周和15周的雄性SHR大鼠（由上海斯萊克實驗動物中心提供），用尾袖法連續無創測鼠尾動脈壓1周，時間均固定于8：00～14：00，每只大鼠在其安靜狀態下測量血壓3次，隨機取血壓平均值超過正常上限的大鼠各12只入組，分為16周高血壓的LVH組和8周高血壓無LVH的非LVH對照組，另購15周雄性Wistar大鼠12只連續測壓1周確定血壓在正常水平后作為空白對照組。Masson染色試劑盒（上海生工）；Langendorff離體心臟灌流系統、ALC－B5恒流泵、MPA－心功能分析系統（上海奧爾科特生物科技有限公司）；MS4000U生物信號定量記錄分析系統（廣州市龍飛達科技有限公司）；XD－2A型心臟電生理診療儀（蘇州東方電子儀器廠）；針灸針電極，自制。本實驗所需其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 Langendorff離體心臟灌注 用木錘擊昏動物后，迅速將心臟連同一段主動脈取出，將主動脈套進心臟插管口內固定。心臟經充氧的溫K－H液（以95%O2＋5%CO2混合氣飽和，恒溫37 ℃，NaCl 6.92g／L，KCl 0.35g／L，CaCl20.28 g／L，MgSO4·7H2O 0.29g／L，KH2PO40.16g／L，NaHCO32.1g／L，葡萄糖2.0g／L，pH 7.4）預灌流。將2個電極分別置于心臟心尖部和主動脈根部，連接多道生物信號記錄儀。首先灌流K－H液20min后，灌入低鉀液（KCl 0.175g／L，其余同普通K－H液）60min（除非持續時間大于2min的SVF提早出現），同時記錄心臟心室內壓和流出液，心電示波器全程監測并記錄心電圖（ECG），觀察各組發生心律失常的情況。參照心律失常評分標準［2］進行評分，并參照文獻［3］剔除不合格樣本。

1.2.2 大鼠心肌組織病理學檢查 將大鼠離體心臟用生理鹽水沖洗吸干，將左心室游離壁心肌組織固定于10%甲醛液中作常規石蠟切片，蘇木素－伊紅（HE）染色后鏡檢以檢測大鼠心肌組織病理學改變。

1.2.3 大鼠心肌組織Masson染色觀察左室心肌間質纖維沉積 5μm組織切片；常規脫蠟；蘇木素染色2min，水洗；1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗10min；麗春紅酸性品紅染5min，水洗。1%磷鋁酸處理1min；2%苯胺藍染1min，1%冰醋酸浸洗1min；95%乙醇快速滴洗3次；常規脫水、透明、封片；光鏡觀察。計算心肌組織膠原纖維面積占整個組織面積的百分比，即膠原容積分數（CVF）＝膠原面積／總面積，所有標本均取3個視野測量，計算其均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用ANOVA中的q檢驗法；計數資料采用Fisher確切概率法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Langendorff離體心臟灌注各指標比較 Langendorff灌注標準K－H液過程中，各組心率未見明顯差異（P＞0.05）；灌注低鉀液1～5min后各組心率有所降低。灌注低鉀液后，室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）、室性早搏（ventricular premature beat，PVB）出現時間早于短暫室顫（transient ventricular fibrillation，TVF）或持續性室顫（sustained ventricular fibrillation，SVF）。灌流低鉀液后，LVH組開始出現VA的時間明顯早于非LVH對照組和空白對照組（P＜0.05）。隨后，LVH組出現SVF的時間（8min后）也明顯早于非LVH對照組和空白對照組（18min后）。LVH組的VA評分與非LVH對照組和空白對照組相比較均顯著增高（P＜0.05），見表1。

表1 Langendorff離體心臟灌注各指標比較

續表1 Langendorff離體心臟灌注各指標比較

2.2 大鼠心肌組織病理變化 空白對照組表現為大鼠左心室心肌纖維間質和細胞形態大小接近正常，胞漿染色均勻。LVH組大鼠的心肌細胞間質增多，心肌纖維可見溶解斷裂，細胞明顯肥大。非LVH對照組病理改變介于LVH組和空白對照組之間。

2.3 Masson染色觀察左室心肌間質纖維沉積 LVH組心肌內膠原組織明顯增多，圍繞心肌細胞的膠原纖維網斷裂、排列紊亂；空白對照組肌間隙很窄，無明顯膠原組織分布，相鄰細胞的膠原纖維網完好，著色淡；非LVH對照組介于LVH組和空白對照組之間。LVH組（0.30±0.05）與非LVH對照組（0.10±0.03）、空白對照組（0.08±0.03）比較，CVF明顯增高（P＜0.05），表明LVH組大鼠左心室出現了明顯重構現象，與非LVH對照組、空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），非LVH對照組和空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

多項臨床研究證明，伴有LVH的高血壓患者容易引發VA，從而增加心血管事件尤其是猝死風險。Fialová等［4］對由L－NAME誘導的高血壓大鼠和SHR大鼠2種模型的Langendorff離體心臟灌注低鉀液后發現，室顫發生率均明顯高于正常對照組（83.3%vs.62.5%vs.25%～33.3%），并伴隨著連接蛋白43（Cx43）表達降低。作者由此認為，由高血壓介導的縫隙連接重構是促使惡性VA發生的重要因素，這為本研究提供了先證。

高血壓左室重構主要表現為LVH和心肌纖維化，而LVH即心肌細胞肥厚主要表現為心肌細胞體積的增大和“胎兒化表型”的出現。SHR大鼠的病理生理狀態與人類原發性高血壓非常接近，5～6周齡時開始逐漸出現血壓增高，14～16周齡時LVH已明確形成并逐漸進展，是應用于高血壓發病機制研究的理想動物模型。本研究采用Langendorff低鉀液灌流對SHR大鼠以及正常大鼠的左室心肌組織進行VA的誘發后發現，LVH組大鼠心肌間質增多，心肌細胞明顯肥大。LVH組大鼠心臟在灌流低鉀液后發生各種VA的概率明顯高于非LVH對照組和空白對照組，提示K＋紊亂更容易促使LVH心肌誘發惡性心律失常，與Tribulova等［5］研究結論相一致。可能的機制為［6］：肥厚心肌增加了細胞興奮性和傳導性，纖維化和灶性肌溶壞死使局部心肌細胞電活動不穩定而產生折返環、室壁肥厚、耗氧量增加導致心肌復極的延緩及離散等。在此病理基礎上由低鉀液灌流引發急性電生理失衡時，細胞外K＋濃度降低，依賴于膜電位的快鈉通道失活，進一步惡化LVH所致心肌病理改變，導致心肌產生鈣超載［7－8］。后者能夠激活Ca2＋依賴的蛋白酶Calpains而導致溶酶體釋放［9］，還可促使Cx43降解增加［10］。而Cx43是哺乳動物心肌縫隙連接中主要的連接蛋白之一，其數量和分布的異常正是多種VA發生的解剖學基礎［11］。

另一方面，本實驗發現，隨著低鉀液灌注時間的延長，LVH組與非LVH對照組、空白對照組比較，大鼠離體心臟在低鉀液灌注后明顯易感惡性VA，且VA發生嚴重程度更高，起始時間更早，持續時間更久，見表1。由此說明，LVH不僅與心血管事件密切相關，而且還可能是急慢性心血管事件（如急性低鉀血癥）引發VA的重要背景環境，甚至可能作為心血管事件重要的預測指標。在此之前，Kannel等［12－13］就觀察到，當個體在心臟超聲下確診LVH時，總病死率增加5倍，心血管事件病死率增加8倍，男性和女性的猝死率各增加6倍和3倍。在另一項多因素分析研究中［14］，有人指出男性患者左心室體積每增加50g／m2，心血管疾病死亡的相對風險指數就增加1.73，而女性數值為2.12。Martins等［15］也發現，將22只正常血壓和18只慢性高血壓伴有LVH的犬進行左前降支冠狀動脈結扎術3h后，在存活下來的8只LVH犬中有7只和8只無LVH的正常血壓犬中出現持續性單型VA。這些研究也強烈支持本實驗觀點。

本研究運用Langendorff低鉀液灌流SHR大鼠LVH離體心臟模型，結果顯示伴有LVH的SHR大鼠VA的發生概率和嚴重程度較無LVH的SHR大鼠明顯增加，提示LVH與VA的發生密切相關，LVH可能正是高血壓負荷下急慢性心血管事件引發VA的必要背景環境，進一步地確證了臨床上認為伴有LVH的高血壓患者的VA發生率較無LVH的高血壓患者明顯增高的觀點，為VA發生的分子機制研究提供了可靠的數據基礎。

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