乙型肝炎病毒及黃曲霉毒素暴露的肝細胞癌中β－catenin、PTEN 的 mRNA表達＊

陳德鳳，齊魯楠，彭 濤，羅國容，黎樂群△

（1.廣西醫科大學研究生學院，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科，廣西南寧 530021；3.廣西醫科大學第一附屬醫院肝膽外科，廣西南寧 530021；4.廣西醫科大學基礎醫學院，廣西南寧 530021）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一［1］，其發病率在中國呈逐年上升趨勢，2007年衛生部統計肝癌死因位于惡性腫瘤死因的第二位，并且乙型肝炎病毒（HBV）的高感染率和黃曲霉毒素B1（AFB1）的高暴露是原發性肝癌高發的主要因素 之一［2－3］。有研究表 明［4］，βcatenin基因突變與肝癌發生有關，而HBV與AFB1的高暴露均能夠導致β－catenin基因的突變并同時影響β－catenin蛋白的磷酸化。9.5%肝癌患者抑癌基因第10號染色體缺失與PTEN基因存在第4、5和8外顯子的突變［5］。肝癌的發生是一個多基因和多步驟的過程，肝癌發生、發展過程中HBV與AFB1可能共同作用促使β－catenin基因和PTEN基因發生改變，為探索HBV和AFB1不同暴露情況下β－catenin基因和PTEN基因mRNA表達與HCC的關系，本研究運用逆轉錄－PCR（RT－PCR）法從基因水平檢測β－catenin和PTEN 基因表達情況，為HBV及AFB1高暴露的地區開展HCC的預防和早期診療研究提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 108例HCC組織標本收集于廣西醫科大學附屬第一附屬醫院肝膽外科和廣西醫科大學附屬腫瘤醫院的標本庫，標本時間為2008年5月至2010年7月，同時設正常對照組20例，取自正常肝組織標本，主要為肝血管瘤、肝外傷、肝移植供體標本。手術標本的病例包括男95例，女13例；年齡28～78歲，平均48.6歲；肝癌直徑為2.0～16.5cm，平均6.8cm。HBV暴露陽性標準為血清中HBsAg（＋），AFB1暴露標準為癌組織中AFB1－DNA加合物免疫組織化學陽性［6］。根據上述檢測結果以及研究目的，108例HCC患者根據HBV與 AFB1的暴露情況，分為4組，A組：HBV（＋）／AFB1（＋）48例；B組：HBV（＋）／AFB1（－）27例；C 組：HBV（－）／AFB1（＋）19例；D組：HBV（－）／AFB1（－）14例。所有患者術前均未接受放化療處理，術后病理診斷均證實為HCC，所有選取的病例均履行告知義務并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 AFB1－DNA加合物檢測方法 免疫組織化學染色：參照Santella等［7］的染色步驟。需同時設立陽性和陰性對照（對照組的大鼠肝組織均由美國哥倫比亞大學Regina M.Santella教授惠贈）。陽性對照取1年雄性SD大鼠行腹腔注射AFB11.0mg／kg和2.5mg／kg劑量，2h后處死取大鼠肝組織，未行腹腔注射AFB1的大鼠肝組織作為陰性對照。經免疫組織化學染色后在顯微鏡下觀察，陽性定義標準為切片背景清晰同時肝細胞核結構完整，在細胞核內出現紫黑色點狀顆粒。陰性定義標準為在肝細胞核內無紫黑色點狀顆粒。

1.2.2 RT－PCR法檢測β－catenin與PTEN 基因的表達

1.2.2.1 癌組織總RNA的提取、RNA逆轉錄成cDNA 以Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測OD值，計算RNA含量和純度。用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒進行RNA逆轉錄。

1.2.2.2 PCR引物的設計與合成 由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。根據Genebank中公布的人β－catenin基因、PTEN 和GAPDH 基因的 mRNA序列，使用Primer Premier5.0引物設計軟件進行設計，并使用BLAST驗證為基因的特異性引物（各基因的正義引物和反義引物序列均跨至少一個內含子）。

1.2.2.3 PCR反應條件 將各試劑按順序加入到PCR反應管中并混合后分裝，每管的總反應體系為25μL。所用試劑為北京天根公司2×Tap PCR MasterMix，包括：2×MasterMix 12.5μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板10～100ng，滅菌雙蒸水補至25μL。反應條件：β－catenin 基因：95℃預變性5 min；變性95℃30s，退火54℃40s，延伸72℃40s，35個循環；72℃延伸10min。PTEN基因：95℃預變性5min；變性95℃30s，退火57℃40s，延伸72℃40s，35個循環；72℃延伸10min。GAPDH基因反應條件：95℃預變性5min；變性95℃30s，退火55℃40s，延伸72℃40s，35個循環；72℃延伸10min。以上反應均終止于4℃。

1.2.2.4 PCR產物分析 將PCR產物電泳后的凝膠置于分析儀觀察，同時拍下圖片進行分析。圖片結果采用Quantity One軟件分析基因的灰度值，平均灰度值減去背景灰度值之差為統計分析數值，β－catenin基因與PTEN 基因的統計值為其灰度值與GAPDH 灰度值之比。

1.3 統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統計學處理。計量資料的各組間均數比較，符合正態分布采用方差分析或成組設計兩樣本t檢驗，不符合正態分布的資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 β－catenin基因mRNA的表達情況 RT－PCR結果顯示，β－catenin基因mRNA的平均半定量灰度值A組、C組分別與D組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，4個亞組與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1、圖1。

表1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值比較（）

表1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值比較（）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與C組比較；d：P＜0.05，與D組比較。

48 1.13±0.14 B組 27 1.06±0.12 C組 19 1.16±0.18 D組 14 1.01±0.13ac正常對照組 20 0.85±0.13灰度值A組組別 n abcd

圖1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值

2.2 PTEN基因mRNA的表達情況 RT－PCR的結果顯示，PTEN基因mRNA的平均半定量灰度值A組與C組及B組與D組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，A、B、D組與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 各組PTENmRNA半定量灰度值比較（）

表2 各組PTENmRNA半定量灰度值比較（）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與D組比較。

48 0.54±0.13 B組 27 0.59±0.16 C組 19 0.97±0.16ab D組 14 0.92±0.13ab正常對照組 20 1.10±0.16灰度值A組組別 n abc

圖2 各組PTENmRNA半定量灰度值

3 討 論

本研究結果提示，β－catenin基因的高表達率可能與AFB1高暴露有關。AFT是寄生曲霉、黃曲霉等真菌的代謝產物，根據其細微結構的不同可分為B1、B2、G1、G2、M1、M2等多種化合物，化學結構類似，在環境中廣泛存在，尤其在高溫潮濕地區的霉變食品中［8］。研究發現，AFB1的毒性最強且對肝的致癌性最大［9］。AFB1致癌的可能機制是DNA損傷引起抑癌基因p53和癌基因ras突變，DNA損傷后DNA上出現堿基突變或堿基空缺，使p53的DNA復制及轉錄過程受阻［10］。

本研究發現AFB1高暴露組的β－catenin基因表達率顯著高于其他各組，C組的表達趨勢高于B組，作為單獨因素存在時，AFB1的效應要高于 HBV，而β－catenin表達在A組中最高，則提示當兩種因素同時存在時，對β－catenin表達可能具有協同效應。Tien等［11］的研究發現癌細胞高及中分化的HCC中β－catenin 顯著增高，與本研究結果一致。Wnt／β－catenin 信號通路與腫瘤形成有關，通過轉錄翻譯后修飾激活靶基因啟動肝癌再生程序［12－13］。β－catenin 基因的高表達率可能是β－catenin在細胞膜的積聚影響細胞間的黏附，進而影響HCC的發生、發展。

在本研究中，在HBV高感染組中，PTEN基因的mRNA表達半定量灰度值低于其他各組，提示PTEN基因失活與HBV高感染率有關。PTEN是繼p53及Rb之后發現的重要抑癌基因，在多種惡性腫瘤中存在此基因表達降低［14－15］，PTEN在細胞內的主要作用機制是影響細胞內蛋白質磷酸化水平，通過其脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶發揮作用，PTEN低表達促使腫瘤發生、發展。本研究中運用RT－PCR技術檢測PTENmRNA表達的半定量灰度值在A組與B組中要顯著低于C組與D組。而前兩組的共同點均為HBV感染陽性。由此本研究推斷HBV的感染是導致PTEN基因失活的因素之一，HBV的影響途徑可能是通過引起PTEN的缺失來降低PTEN基因的表達。HBV／AFB1雙暴露的HCC中，PTEN的表達水平明顯下降，推斷與HBV和AFB1具有協同作用有關，而PTEN基因的表達下調則可能主要與HBV感染有關，AFB1對PTEN基因的表達下調可能有輔助協同作用。

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