長爪沙鼠的生物凈化技術

盧領群，宋曉明，戴方偉，周莎桑，李長龍, 馬偉鋒，柯賢福，樓 琦，呂 宇，薩曉嬰

(1.浙江省醫學科學院實驗動物中心, 杭州 310013;2.杭州師范大學實驗動物中心, 杭州 310036；3.首都醫科大學基礎醫學院實驗動物學系，北京 100069)

長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)屬于嚙齒目、沙鼠屬(Gerbillus)動物。野生型沙鼠主要分布在我國西北、華北及蒙古的干旱和半干旱地區的草原地帶。1935年由日本人開始馴化和實驗動物化，轉而由Schwentker引入美國、英國和法國等國家[1]，于20世紀60年代開始作為實驗動物應用于醫學研究。長爪沙鼠具有許多特殊的生物學特性，可作為生物學和醫學研究的動物模型，被稱為“多能性”的實驗動物[2]。目前國內有兩個主要的長爪沙鼠群體，分別保存于浙江省實驗動物中心(命名為Z:ZCLA)和首都醫科大學[1]，其中的Z:ZCLA長爪沙鼠種群經48代選育，已育成一個生物學性能穩定的普通級長爪沙鼠新品系。為適應國家對我國特色品系實驗動物化的整體要求，促進長爪沙鼠品系的應用和國內特色資源的保種，我們對該長爪沙鼠群體實施微生物質量升級和實驗動物化。由于采用精子體外受精技術實現生物凈化客觀上缺乏合適的受體鼠，我們選擇剖腹摘宮技術對長爪沙鼠進行生物凈化，該技術在實驗動物的微生物凈化、無菌動物的繁育等方面應用普遍[3]。因長爪沙鼠的特殊性，整個生物凈化過程需克服孕鼠選擇和臨產期判斷、無菌剖宮產、仔鼠代乳等諸方面的技術難關，本文就上述過程進行簡要匯總，以期為我國其他特色實驗動物資源的實驗動物化提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級Z:ZCLA長爪沙鼠和清潔級ICR小鼠、SD大鼠均由浙江省實驗動物中心提供，使用許可證號：SYXK(浙)2008-0114、SYXK(浙)2008-0113，獨立通風籠盒環境中飼育，清潔級長爪沙鼠由上述普通級長爪沙鼠經生物凈化建立。

1.2 實驗材料

獨立通風籠盒(IVC)，蘇杭公司生產；超凈工作臺由蘇州凈化設備有限公司生產。一般物品包括：乳膠手套、油汀、溫度計、量筒、滅菌蒸餾水、質量百分濃度為2% 過氧乙酸消毒液(臨用前用35℃ 的蒸餾水配制)、質量百分濃度5 % NaOH堿液；手術用物品包括：鑷子(15 cm規格)2把，眼科鑷2把，手術刀1把，手術剪2把，脫脂棉，紗布，止血鉗4～5把，以上手術器具需經121℃5磅高壓蒸汽滅菌20 min。

鼠飼料為輻照繁殖料，由浙江省實驗動物飼料生產基地提供，質量規格：φ12 mm 顆粒。兔乳為泌乳期母兔分泌的乳汁，經高壓蒸汽(115℃，15 min)滅菌后備用。輔料的制備：將鼠飼料碾碎成粉末，置無菌瓶皿中，添加滅菌后的兔乳，充分攪拌混勻至適當濕度即可。

1.3 長爪沙鼠孕鼠選擇和臨產期判斷

選擇3月齡普通級長爪沙鼠，按雌雄比1:1同居交配。通過①觀察法：觀察分娩前孕鼠躁動不安、清理產床，孕鼠下腹部膨大、外陰濕潤鮮紅且陰道口擴大，待孕鼠俯臥巢內并見流血和羊水后表明即將分娩；②觸診法：安靜自然保定分娩期孕鼠，通過觸摸其腹部，對比感覺腹肌松弛度，胎仔頭硬度，胎仔頭和軀干大小。當胎仔頭和軀干大小一致(寬度達到約0.8～1.2 cm)，腹肌松弛，胎仔頭較硬時，則孕鼠分娩時機成熟。在此基礎上，提前(2～3)h對孕鼠肌內注射適當劑量的黃體酮，并于注射后(12～24)h內施行剖宮產手術。須注意每只動物黃體酮注射總劑量不超過6 mg，次數不超過3次。

1.4 剖宮產手術

整個手術應無菌操作。采用頸椎脫臼法處死孕鼠后，迅速將其浸入質量百分濃度為2% 過氧乙酸消毒液5 s，置于手術臺，固定四肢。消毒孕鼠腹部，用滅菌剪打開腹腔，暴露子宮。用止血鉗夾住兩側輸卵管前側和子宮遠端(圖1)，從遠端迅速切斷子宮。切取子宮后，將其連同止血鉗迅速放入35℃消毒液中浸泡約10 s。立即以質量百分濃度5% NaOH堿液(溶劑為水)中和消毒液，蒸餾水沖洗后，紗布吸干。迅速撕開子宮，破羊膜取出胎仔，紗布或棉簽去除羊水，擦凈胎盤和胎仔，特別是胎仔口鼻處。以濕棉簽輕輕按摩胎仔胸部，刺激其獲得自主呼吸，全過程需保溫，直至胎仔全身鮮紅，扭曲臍帶，并用紗布扯斷臍帶壓迫止血。自主呼吸的仔鼠體色由紫紅逐漸轉成鮮紅色，約半小時后即可授乳或代乳。

圖1 止血鉗夾住子宮示意圖

1.5 選擇母鼠代乳

分別選取自然分娩第1天的長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠作為代乳母鼠，每種代乳母鼠取8只，每只代乳6只新生長爪沙鼠。所有代乳母鼠、仔長爪沙鼠的飲水、飼料等飼養環境均保持一致，每天記錄窩重和每窩存活數，連續記錄25 d，比較三種動物代乳的仔長爪沙鼠的生長曲線和存活率。

另設四組：ICR泌乳小鼠單純代乳剖宮產仔長爪沙鼠組、ICR泌乳小鼠代乳配合輔料飼養剖宮產仔長爪沙鼠組、ICR小鼠代乳自然分娩仔長爪沙鼠組和親母鼠哺乳組。選擇清潔級ICR泌乳小鼠作為仔長爪沙鼠的代乳母鼠提供母乳，于17日齡時增設輔料添加組，即含67%(v/w，mL兔乳/100 g小鼠飼料粉末)兔乳的鼠飼料粉末，每天按5 g/只的兔乳量添加兩次。代乳期間每3 d更換1次墊料。每組選7窩剖宮產仔長爪沙鼠，每窩留6只，每天記錄窩重和每窩存活數，連續記錄25 d，比較四組仔鼠生長情況。

圖2 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳的自然分娩仔長爪沙鼠每窩存活率趨勢圖

2 結果

2.1 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳自然分娩的仔長爪沙鼠生長情況比較結果

SD大鼠代乳的長爪沙鼠在3日齡時開始出現顯著性死亡，存活率降至80%以下，到11日齡，仔鼠存活率降至47%，在17日齡有2窩仔鼠整體淘汰。仔鼠25日齡時，存活率僅為31%。在整個代乳期，仔鼠均存在陸續死亡現象。ICR小鼠代乳的48只仔鼠中，有46只存活，25日齡時存活率為95%。長爪沙鼠代乳的仔鼠中，僅一組動物出現3只死亡，其余45只均存活，見圖2。

通過比較各組仔鼠平均體重(圖3)，我們發現ICR小鼠代乳的仔鼠平均體重在20日齡前略高于長爪沙鼠代乳和SD大鼠代乳的長爪沙鼠，個別日齡存在顯著性差異，表明ICR小鼠代乳的長爪沙鼠生長發育情況較為理想。在20日齡后，與長爪沙鼠代乳的仔鼠比較，ICR小鼠代乳動物體重增重明顯變緩，這可能與ICR小鼠哺乳周期有關。SD大鼠代乳的仔鼠體重變化存在較為明顯的組內波動。綜合上述結果，我們選擇了ICR小鼠作為長爪沙鼠生物凈化后的代乳母鼠。

2.2 剖宮產及代乳情況

共實施長爪沙鼠生物凈化85胎次，通過ICR小鼠代乳并成功斷乳167只，胎仔平均出生體重2.9 g/只，窩平均胎仔數8.4只/窩，共完成20只通過生物凈化后代乳與自然分娩后母乳喂養的長爪沙鼠生長曲線比較(圖4)。與母乳喂養的長爪沙鼠相比，生物凈化后的代乳沙鼠體重普遍較低，從1日齡到25日齡均有統計學差異。

由圖5可知，剖宮產仔長爪沙鼠的生長曲線普遍低于自然分娩組，提示剖宮產手術對仔長爪沙鼠的生長發育帶來較大影響，添加輔料組可顯著提高17日齡后剖宮產仔長爪沙鼠的體重增長速度，并于斷奶前達到優于ICR小鼠代乳自然分娩仔長爪沙鼠組的體重水平，表明所添輔料有助于剖宮產手術中的仔長爪沙鼠實現正常離乳。

圖3 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳自然分娩仔代長爪沙鼠的生長曲線比較

圖4 通過生物凈化后代乳與自然分娩后母乳喂養的長爪沙鼠生長曲線比較

圖5 剖宮產仔長爪沙鼠由ICR小鼠單純代乳與配合輔料飼養、自然分娩仔長爪沙鼠由ICR小鼠代乳和由親母鼠代乳的生長曲線比較

3 討論

3.1 長爪沙鼠孕鼠選擇和臨產期判斷

與大、小鼠不同，長爪沙鼠是“一夫一妻”長期同居的繁殖方式，因此選擇3月齡普通級長爪沙鼠進行雌雄比1∶1同居交配。小鼠的妊娠期為19～21 d，長爪沙鼠妊娠期24 d～26 d，代乳ICR小鼠的交配時間較剖宮產母鼠遲3 d～4 d，即ICR代乳母鼠在剖宮產手術前12～36 h內分娩。由于長爪沙鼠雌鼠在受精后難發現陰栓，其預產期僅能依靠計算雌雄同居時間，結合觀察法、觸診法等[4]綜合方法來判定孕鼠分娩時間點，以把握最佳剖宮產時機，因此這對實驗人員判斷沙鼠臨產期的經驗要求較高。

3.2 黃體酮在長爪沙鼠剖腹取胎中的應用

根據胚胎發育的原理[5]，嚙齒類實驗動物在接近出生前的24 h內生長發育最旺盛，仔鼠初生時20%體重都是在最后24 h內生長的，提早幾個小時進行剖宮產會對胎兒的成熟造成很大影響。為了避免判斷錯誤，確保胎鼠發育完全，在前述診斷基礎上，提前2 h～3 h對孕長爪沙鼠肌注適當劑量的黃體酮[6]，使子宮松弛，收縮力下降，以推遲孕鼠的分娩時間。動物可于注射后12 h～24 h內施行剖宮產術，注意給藥次數不宜過多(總劑量≤6 mg，次數≤3次)，否則易導致剖宮產仔鼠發黑，過于成熟，甚至出現死胎現象。

3.3 無菌剖腹摘宮技術

剖宮產手術是實現生物凈化的有效途徑，可有效防止病原體通過胎盤屏障引起子代的垂直感染。為確保剖宮產手術的無菌狀態，應注意所有與手術有關的物品必須無菌，手術中嚴格執行無菌操作，注意保溫，新生幼仔的剖宮取胎中手術臺環境溫度一般控制在(30～33)℃左右。并對子宮和胎盤進行微生物檢驗，一旦發現污染，馬上棄除該批幼仔。手術應以快為原則，全過程須在10 min～15 min內完成，操作準確、熟練，否則會影響新生鼠的成活率。

3.4 代乳母鼠的選擇

選擇經產、母性好的清潔級雌鼠為剖宮產長爪沙鼠的代乳母鼠。當確定乳母鼠懷孕后，將雄鼠移出，以免再生產，影響帶乳。本研究分別選用SD大鼠、ICR小鼠和普通級長爪沙鼠三種代乳母鼠進行比較。發現SD大鼠的產乳量多，產乳周期短，仔鼠存活率低。長爪沙鼠產乳量和產乳周期雖更符合被乳仔鼠生長需求，但現只有普通級種群，不適合作凈化仔鼠代乳鼠。ICR小鼠易獲得，產乳周期較長，性情溫順，故選擇母性良好的清潔級ICR小鼠作為凈化長爪沙鼠的代乳母鼠。

3.5 提高仔長爪沙鼠代乳成活率方法的探索

在代乳母鼠和仔鼠初次接觸時，采用合理的染味、觀察等方法可提高代乳成功率。代乳技術建立前期，以生產或剛生產完的清潔級ICR泌乳小鼠作為代乳母鼠，發現長爪沙鼠剖腹取胎當日及2 d內仔長爪沙鼠成活率最低。故將產前2 d～3 d的乳母鼠轉移到凈化室適應環境，并停止更換墊料，在其產后第一天是導入被乳仔鼠的最佳時間。乳母鼠初次接觸代乳時，預留親仔1～2只，將仔長爪沙鼠與籠內墊料輕柔地混翻，以確保其充分染味，混養數小時后，若發現仔長爪沙鼠的腹部有白色乳液，表明授乳成功，即可將母鼠親仔取出。

剖宮產的長爪沙鼠生長不穩定，每窩仔鼠離乳體重不一致，20日齡后體重呈明顯下降趨勢，并出現一定數量的死亡。試驗發現在仔鼠17～20日齡時開始添加輔料，每100 g鼠飼料粉末中含兔乳60 mL～70 mL，每天2～5次，視仔鼠的健康及消化情況適當增減，直至仔鼠日體重明顯上升即可考慮斷奶，一般在25～30日齡，體重達16 g后安全離乳。采用添加輔料法有助于剖宮產的仔長爪沙鼠實現正常離乳，并優于代乳自然分娩仔長爪沙鼠的體重水平。

3.6 IVC內飼養環境控制

長爪沙鼠生性好動，墊料消耗大，且易臟。無菌草紙[7]作為墊料，易被叼于一處，造成IVC籠盒內氣流不暢。無菌木屑較為常用，更適于新生鼠代乳期，因產粉塵多，需勤更換。使用玉米芯作為墊料，可以明顯改善籠盒內環境。新生幼仔的環境溫度一般控制在30℃～33℃左右，5 d后降至24℃～27℃左右，濕度40%～70%。

參考文獻：

[1] 李長龍, 盧領群, 郭紅剛, 等. 長爪沙鼠線粒體DNA控制區全序列測定及分析[J]. 中國比較醫學雜志, 2010, 20(4):40-45.

[2] 戴方偉,周莎桑,宋曉明, 等. 生物凈化前后長爪沙鼠微生物和寄生蟲攜帶情況的比較 [J]. 中國比較醫學雜志, 2012, 32(6): 473-476.

[3] 李蘭娟, 康白, 熊德鑫, 等. 感染微生態學 [M]. 北京: 人民衛生出版社出版. 2012： 711-723.

[4] 戴方偉, 盧領群, 金曉音, 等. 大鼠臨產期判斷方法的探討[J]. 中國比較醫學雜志, 2006, 4:233-235.

[5] 徐平. 小鼠剖宮產育仔若干問題探討 [J]. 上海實驗動物科學, 1990, 10(4): 222-223.

[6] 吳為群, 容中生. 哮喘, 黃體酮和妊娠 [J]. 國外醫學內科學分冊, 1993, 18(12): 557-558.

[7] 王瓏, 張海峰, 劉艷, 等. 嚙齒類實驗動物墊料質量評估的研究 [J]. 實驗動物科學， 2011, 28(1): 30-32.