膽汁淤積性肝硬化大鼠模型的改良

宣 佶，田耀洲，曹 鵬，胡春萍，蔡雪婷，張 偉

(1．南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046；2．解放軍81醫院，江蘇 南京 210002；3．江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210002；4.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210002；5. 中國中醫科學院江蘇分院，江蘇 南京 210002)

肝纖維化是多種慢性肝病發展為肝硬化的必經階段，阻斷肝纖維化是慢性肝病治療中的關鍵問題[1]。為了更好地研究肝纖維化的發生機制以及藥物對該病的療效和治療途徑，需要建立穩定、高效、可靠的肝纖維化動物模型[2,3]。國內文獻對膽總管結扎模型建立的手術操作過程描述過于簡單，不利于模型的復制，同時關于其造模成功率僅做了短期內的統計和評價，無法反映動物模型的遠期可靠及穩定性[3-5,7]，為此，筆者在研究膽汁淤積性肝硬化的藥物治療中，曾先后兩次建立膽汁淤積性肝硬化大鼠模型，本文擬報告造模過程，并探討一種方法簡便、成功率高、存活時間長、切實可行的造模方法。

1 膽總管結扎法

1.1 材料

清潔級SD大鼠40只由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK(滬)2007-0005；使用證號SYXK(蘇)2011-0017，雄性，體重(180±20)g，購于南京青龍山動物繁殖場。

1.2 方法

SD雄性成熟大鼠40只，隨機分為膽總管模型組(n=30)和假手術組(n=10)，禁食禁水24 h。進行稱重，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，腹腔注射麻醉，仰位固定于固定板上，消毒切口，沿腹部正中線大鼠劍突以下約1．5～2 cm之間切口，打開腹腔，找到胃幽門部，翻轉十二指腸，在十二指腸周圍有淡粉色類似脂肪的就是胰腺；將胰腺展開后在胰腺中仔細尋找透明的管狀物，該導管是從肝臟發出最后走行進入十二指腸，內有淡黃色液體，即為膽管。膽總管模型組暴露膽總管，于膽總管中段雙重結扎，查腹腔內無活動性出血后，常規關腹(圖1)。假手術組僅暴露膽總管，不予結扎，常規關腹。術后連續3 d注射青霉素40萬U/只，禁水12 h，禁食24 h后正常喂養。術后1周眼眶取血檢測血清學指標谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)、白蛋白/球蛋白(A/G)，術后4周取膽總管結扎和假手術小鼠肝組織塊常規石臘切片，進行HE染色，光鏡觀察；取肝組織塊經SP法免疫組織化學染色。石臘切片經梯度乙醇脫水，甲醇過氧化氫封閉后，分別用抗α-SMA mAb和抗CK-19 mAb 37℃孵育1 h，辣根過氧化物酶偶聯的抗小鼠的二抗，37℃孵育0.5 h，二氨基聯苯胺顯色。用PBS代替一抗做為陰性對照。計算機掃描分析蛋白的陽性數目、灰度值和相對光密度。

1.3 結果

膽總管模型組大鼠術后尿黃，大便呈陶土色，但正常喂養后，膽總管模型組大鼠逐漸出現精神萎靡，腹脹腹水明顯，術后14 d隨機其中5只大鼠，抽取腹水以AMS酶法測定腹水淀粉酶，提示腹水淀粉酶明顯升高(表1)，假手術組大鼠術后無精神萎靡，無腹水，毛發有光澤，進食進水正常，大小便正常，體重逐日增加。一周眼眶取血行血清學指標 (AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT) 檢測，對比假手術組模型組大鼠血清膽紅素明顯增高，肝功能異常(表2)，提示梗阻性黃疸模型成功，但是術后模型組相繼出現死亡，1月內累計死亡20只，死亡率達66.7%，剖檢尸體發現胰腺壞死，大量腹水，腸道脹氣明顯。術后4周進行組織形態學觀察，膽總管模型組病理提示散在炎性細胞浸潤，匯管區小膽管明顯增生，纖維結締組織增生將肝小葉分割成假小葉結構。免疫組化染色顯示，模型組肝臟匯管區小膽管周圍可見CK-19陽性的棕褐色細胞明顯增生,肝組織α-SMA陽性的棕褐色細胞明顯增多，成纖維細胞大量增生(圖2，見封三)，膽總管模型組CK-19、α-SMA蛋白的陽性數目、灰度值和相對光密度表達水平升高(表3)。

2 肝門部肝總管縫扎法

2.1 材料

清潔級SD大鼠40只，雄性，體重(180±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，購于南京青龍山動物繁殖場,合格證號:SCXK(滬)2007-005；使用證號SYXK(蘇)2011-0017。

2.2 方法

SD雄性成熟大鼠40只，隨機分為肝總管模型組(n=30)和假手術組(n=10)，禁食禁水24 h。進行稱重，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，腹腔注射麻醉，仰位固定于固定板上，消毒切口，沿腹部正中線大鼠劍突以下約1.5～2 cm之間切口，打開腹腔，暴露膽總管，沿膽總管向上找到肝門部，見此處無胰腺組織，拉鉤充分暴露術野，于肝總管近肝門部以5-0絲線單純縫扎，查腹腔內無活動性出血后，常規關腹(圖1)。假手術組僅暴露肝總管，不予結扎，常規關腹。術后連續3 d注射青霉素40萬U/只，禁水24 h，禁食48 h后正常喂水，少量喂食，1周后正常喂養。術后1周眼眶取血行血清學指標(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT、A/G)檢測，術后4周取膽總管結扎和假手術小鼠肝組織塊常規石臘切片，進行HE染色，光鏡觀察；取肝組織塊經SP法免疫組織化學染色,方法同上。

2.3 結果

肝總管模型組大鼠術后尿黃，大便呈陶土色，正常喂養后，無精神萎靡，一般情況良好，近期并無腹水腹脹等情況，假手術組大鼠術后無精神萎靡，毛發有光澤，進食進水正常，大小便正常，體重逐日增加。術后一周眼眶取血行血清學指標(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT)檢測，對比假手術組模型組大鼠血清膽紅素明顯增高，肝功能異常，提示梗阻性黃疸模型成功，14 d后部分大鼠出現少量腹水，查腹水淀粉酶未見異常(表1),1月內累計死亡8只，死亡率達26.7%。術后4周進行組織形態學觀察，肝總管模型組病理提示散在炎性細胞浸潤，匯管區小膽管明顯增生，纖維結締組織增生將肝小葉分割成假小葉結構。免疫組化染色顯示，模型組肝臟匯管區小膽管周圍可見CK-19陽性的棕褐色細胞明顯增生,肝組織α-SMA陽性的棕褐色細胞明顯增多，成纖維細胞大量增生(圖2見封三)，肝總管模型組CK-19、α-SMA蛋白的陽性數目、灰度值和相對光密度表達水平升高(表3)。

表1 腹水淀粉酶測定

表2肝功能生化指標

Tab.2Biochemical indices of liver function

注：與假手術組比，* P<0.05；與膽總管模型組相比，# P > 0.05

表3 各組大鼠肝組織CK-19、α-SMA免疫組化染色的表達水平

3 討論

肝纖維化動物模型在肝纖維化的發生機制以及藥物研究中應用廣泛，方法多樣，膽總管結扎術是其中一種經典造模方法，該模型的原理與發生在人體的繼發性膽源性肝硬化的機制相吻合，形成人為的肝外膽道梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴張、膽汁淤積、膽道內壓力增高，并可引發肝內膽小管擴張破裂[5,6]，國內文獻報道該模型短期內存活率在75%～83.3%之間[3-5,7]，但筆者發現該經典方法造模后模型動物1月內死亡率仍然偏高，很難滿足實驗藥物療效觀察。

筆者第一次造模，采用經典的結扎膽總管法，死亡率較高，成本較大。觀察發現模型大鼠術后當天一般情況可，并無死亡，術后第二天進食進水后，逐漸出現精神萎靡、腹部膨隆等情況，并且逐日加重，3 d后陸續出現死亡，期間抽取腹水查淀粉酶提示明顯增高，剖檢死亡大鼠發現腹腔內大量腹水，胰腺液化壞死，腸道明顯脹氣。結合大鼠體征、血液及腹水生化及剖檢結果，分析大鼠死亡原因考慮為急性胰腺炎可能性較大，進而導致腹水淀粉酶明顯升高，剖檢時發現腸道脹氣也與胰腺炎引起的麻痹性腸梗阻有關。通過仔細研究大鼠膽道解剖及胰腺分布，發現大鼠膽總管于胰腺內走行，且管腔十分纖細，不易尋找和暴露，術中對胰腺中膽管的牽拉、分離解剖、結扎都不可避免的造成一定的胰腺損傷，加之術后過早喂食，促進胰腺分泌，進一步加重胰腺壞死，最終造成模型動物死亡。因此，筆者對第一次造模死亡率偏高主要原因總結為術中胰腺損傷和術后過早喂食刺激并加重胰腺壞死有關。

經過仔細研究大鼠解剖結構，筆者發現大鼠的肝總管位于左右肝管匯合部遠心端，位置固定，易于尋找及暴露，且無胰腺組織包裹，于此處結扎膽道既可以有效阻斷膽道又可以減少損傷胰腺風險。因此第二次以肝門部肝總管縫扎法進行造模，以眼科針穿5-0絲線(盡量減少周圍組織損傷)進行單純縫扎，術中小心操作，最大限度的減少分離、結扎膽管造成的牽拉，避免損傷胰腺組織，造模后適當推遲給水喂食時間，推遲并減少胰腺分泌。術后發現肝總管模型組的大鼠給食后無精神萎靡，一般情況良好，1周內并無腹部膨隆飽脹等情況，術后第二周部分大鼠出現少量腹水，查腹水淀粉酶未見異常，考慮與肝硬化后影響蛋白合成有關造成的腹水有關。

本實驗中, 各組大鼠血液生化提示兩個模型組大鼠較假手術組膽紅素、轉氨酶等指標明顯升高并伴有蛋白合成障礙；HE染色結果顯示散在炎性細胞浸潤，匯管區小膽管明顯增生，纖維結締組織增生將肝小葉分割成假小葉結構，同時我們利用膽管上皮細胞特異性標志-細胞角蛋白19 (CK-19)免疫組化染色提示,膽管上皮細胞明顯增生。以上結果均反映出兩組模型組大鼠肝臟功能受損、細胞炎性反應、小膽管細胞增生明顯等一系列病理表現。另外，肝纖維化的顯著特征是細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的增加和成分的改變，而肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化和增殖是其關鍵和中心環節[8-10]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是肝星狀細胞活化的特征性標志物，免疫組化顯示兩組模型組大鼠肝臟α-SMA陽性細胞明顯增加，提示成纖維細胞大量增生，進一步證實膽道結扎后大鼠肝臟纖維化的病理改變。

因此本研究表明對于以上兩種造模方法均可以有效制造膽汁淤積性肝硬化動物模型，但是前者死亡率較高，因此往往需要多次補做模型，時間和經費成本相對較大，而肝門部肝總管縫扎法，具有解剖位置固定、易于尋找和暴露、術后并發胰腺炎可能性小、成模率高、存活時間長等優點，是一種切實、方便、可行的造模方法。筆者通過實驗成功建立了膽汁淤積性肝硬化大鼠模型，對經典的膽總管結扎造模方法進行適當改進，降低了造模的死亡率，提高了肝纖維化模型質量和實驗效率。

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