應(yīng)用微衛(wèi)星和下頜骨形態(tài)分析法對不同昆明小鼠種群進(jìn)行遺傳分析

韓喜彬，王立辛，蘇玉虹，巴彩鳳

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，錦州 121001； 2.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，錦州 121001)

昆明(KM)小鼠中國應(yīng)用廣泛的封閉群實驗小鼠，在科研、教學(xué)和檢定實驗中被大量使用，經(jīng)過多年繁育不同單位的種群攜帶著或多或少改變的基因位點，這種變化位點的累計最終會導(dǎo)致具體的性狀改變，使實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性大大降低，所以急需對KM小鼠乃至所有封閉群動物建立遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，通過遺傳監(jiān)測使其保持遺傳穩(wěn)定性[1]。國內(nèi)實驗動物學(xué)界已經(jīng)意識到昆明小鼠的遺傳質(zhì)量問題，較早的報道證明了不同來源的KM小鼠在體型特征、血液指標(biāo)和實驗反應(yīng)特性等方面存在差別[2-4]；而近年以STR分析KM小鼠遺傳特征的報道較多，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種群之間存在中等或較大程度的遺傳背景差異[5-7]。遺傳控制的關(guān)鍵在于遺傳的穩(wěn)定性，即群體基因的數(shù)量和基因型頻率始終保持不變，從而貯藏現(xiàn)存的遺傳雜合性，從這一角度考量基因水平的監(jiān)測必不可少，另外，動物實驗是針對個體表型的測量和觀察，遺傳控制的結(jié)果是表型穩(wěn)定，所以必須測量宏觀指標(biāo)。本研究選擇微衛(wèi)星法和下頜骨形態(tài)法對KM小鼠進(jìn)行遺傳分析，將遺傳的內(nèi)因、外因相結(jié)合，以期為封閉群動物的遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

昆明小鼠60只，(20±1)g，雌雄各半，SPF級。30只購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部8周齡昆明小鼠(SCXK(遼)2008-0005，簡稱A種群)；30只購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SCXK(遼)2008-0002，簡稱B種群)。兩個昆明小鼠種群都引種自北京國家嚙齒類實驗動物種子中心，封閉時間8年以上。實驗完成于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(SYXK(遼)2008-0004)。

1.2 實驗方法

1.2.1 下頜骨形態(tài)分析：下頜骨測量位點參照Festing[8]建立的方法，共利用11個變異函數(shù)，1～6為高度測量點，7～11為長度測量點，均為右側(cè)下頜骨(支)；標(biāo)本制作過程為煮沸3 min，胰酶37℃消化24 h，清水洗凈，拔掉門齒，以黑色背景掃描成圖像，再以Photoshop 8.0分析圖像獲得數(shù)據(jù)(圖1)。

(1～6為高度變量，7～11為長度變量)

1.2.2 微衛(wèi)星檢測：常規(guī)酚氯法提取基因組DNA，參考小鼠基因組數(shù)據(jù)庫 (http://www.informatics.jax.org)及本實驗室之前的研究結(jié)果[9]，選取10個分布在不同染色體的微衛(wèi)星位點，每個位點多態(tài)信息豐富，引物序列見表1。優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，AgNO3染色，根據(jù)泳動距離進(jìn)行結(jié)果判讀，泳動距離最長的帶設(shè)為英文字母a，依次為b、c等，泳動距離一致的為單態(tài)性(單一條帶)，若有差異即為多態(tài)性(多個條帶)。所用試劑均購自大連寶生物公司。平均雜合度(he)、平均多態(tài)信息含量(PIC)和遺傳距離(DA)分析分別按Nei(1974)、Bosein(1980)和Nei(1983)計算(如下)。

1.2.2.1 平均雜合度、多態(tài)信息含量

式中n為特定基因位點上的等位基因數(shù)，Pi、Pj分別等于等位基因的頻率，he為雜合度。

1.2.2.2 遺傳距離

式中：

Xij—X群體中第j個座位上第i個等位基因的頻率；

Yij—Y群體中第j個座位上第i個等位基因的頻率；

表1 微衛(wèi)星位點引物序列及反應(yīng)條件

mj— 第j個座位上的等位基因數(shù)；

r— 檢測的座位數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理：采用SPASS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 下頜骨形態(tài)分析結(jié)果

下頜骨變量測量結(jié)果見表2、圖2。兩單位KM小鼠種群11項參數(shù)中有5個參數(shù)差別明顯，B種群2項高度參數(shù)X4、X5，2項長度參數(shù)X9、X10都大于A種群，差異極顯著 (P﹤0.01)，A種群只有高度參數(shù)X6大于B種群，達(dá)到差異顯著(P﹤0.05)，說明兩個種群小鼠的下頜骨形態(tài)存在一定差別。

表2 KM小鼠下頜骨參數(shù)測量結(jié)果

圖2 KM小鼠下頜骨掃描圖像

2.2 微衛(wèi)星檢測結(jié)果

10個微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果見表3、圖3。兩家單位共檢測出28個等位基因、31個基因型，最多等位基因數(shù)4個，最少1個，平均雜合度(he)0.472，平均多態(tài)信息含量(PIC)0.382。A種群KM小鼠共檢出27個等位基因、28個基因型、平均雜合度0.525、平均多態(tài)信息含量0.402；B種群KM小鼠共檢出26個等位基因、27個基因型、平均雜合度0.418、平均多態(tài)信息含量0.361。兩個種群在D2NDS3等5個位點基因型分布不同，A種群的遺傳多樣性略高于B種群，兩個種群遺傳距離為0.076。

3 討論

在KM小鼠等封閉群動物的繁育過程中，遺傳污染、基因突變和選擇壓都能造成遺傳差異，這種差異體現(xiàn)在異地種群間，也體現(xiàn)在同一種群相隔較遠(yuǎn)的代次間，遺傳監(jiān)測的價值在于及時、盡早地發(fā)現(xiàn)這些變化，在這些變化固定下來之前對種群進(jìn)行調(diào)整，避免基因分布的改變。本研究以微衛(wèi)星法和下頜骨分析法獲得了兩個單位KM小鼠的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，兩個種群的個別位點和形態(tài)參數(shù)差別明顯，說明兩個種群的分化是存在的，根據(jù)此結(jié)果無法說明種群合格與否，因為至今沒有形成KM小鼠封閉群的定性或定量標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果只能說明其遺傳特征。在國內(nèi)的相關(guān)研究報道中，能夠?qū)Ψ忾]群動物的遺傳學(xué)指標(biāo)做出明確說明的不多，其中吳艷花等、李薇等以微衛(wèi)星技術(shù)對國內(nèi)遺傳背景明確的幾個小型豬、長爪沙鼠的種群遺傳特征進(jìn)行了分析，并以群體平均雜合度或平衡狀態(tài)做為群體合格與否的指標(biāo)[10，11]。其他以微衛(wèi)星技術(shù)檢測實驗大鼠或小鼠遺傳結(jié)構(gòu)的報道并不罕見，檢測結(jié)果不但能說明群體遺傳概貌，也能區(qū)分一些品系[12，13]；以遺傳監(jiān)測為目的的下頜骨形態(tài)學(xué)檢測方面的報道很少，陳哲等通過對3種白化小鼠下頜骨變量的研究，探討了其在品系鑒別中的應(yīng)用價值[14]，吳宿慧等探討了下頜骨測量技術(shù)在性別鑒定中的作用[15]，這些研究豐富了封閉群實驗動物的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，雖然未能建立標(biāo)準(zhǔn)，也具備一定參考價值。

表3 KM小鼠10個微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果

1：ab；2：aa；3：ac；4：ac；5：ac；6：ab

現(xiàn)今世界范圍內(nèi)被承認(rèn)的通用標(biāo)準(zhǔn)封閉群有美國Charles River Laboratories CD-1種群(ICR小鼠和SD大鼠)以及日本CLEA的Wistar大鼠種群，兩個機(jī)構(gòu)基礎(chǔ)群的建立方法相同，都取自遺傳背景明確的多個種群，力求建立該品系完整基因庫，再選擇恰當(dāng)?shù)谋O(jiān)測方法，在長期的繁育過程中確定具體的監(jiān)測指標(biāo)和操作規(guī)程，并以此方法指導(dǎo)選種、留種和遷移等。KM小鼠在我國分布廣泛，各地種群遺傳差異大，分化明顯，更為重要的是遺傳背景不明確，所以，目前各個單位有必要對各自種群進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測，完善基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為KM小鼠遺傳學(xué)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)的建立打下基礎(chǔ)，讓這個具有中國特色的品系穩(wěn)定延續(xù)，并可促進(jìn)我國實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化事業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論

兩個KM小鼠種群存在基因結(jié)構(gòu)和表型特征的差異，群間輕度遺傳分化。

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