小鼠α-synuclein基因內含子1甲基化定量檢測方法的建立及不同腦區甲基化水平的比較研究

陸 璐，張 蘭，王丹慧，蔡彥寧

(首都醫科大學宣武醫院藥物研究室,神經變性病教育部重點實驗室,北京 100053)

眾多研究表明，α-突觸核蛋白(alpha-synuclein，α-syn)與神經退行性疾病密切相關。例如，異常聚集和纖維化的α-syn是構成路易體的主要成分，而后者是帕金森病(PD)和路易體癡呆的主要標志[1]。又如，α-syn基因突變可以導致家族性PD[2-4]。此外，α-syn的過度表達能夠引起細胞內氧化應激水平的增加，進而促進α-syn的聚集和一系列的病理變化[5]。

α-syn的轉錄調控極為復雜并且與疾病相關。研究表明，α-syn啟動子區多態性能夠通過影響α-syn的轉錄，增加發生PD的風險[6]。而α-syn的二倍體、三倍體均能增強其轉錄，并使罹患PD風險增加[7, 8]。最近，α-Syn的另一種轉錄調控方式逐漸被揭示并受到重視。多項研究顯示，人α-Syn內含子1存在一個CpG島。PD患者腦組織以及PD患者外周血淋巴細胞中，該CpG島的甲基化水平顯著下降[9, 10]。該CpG島的低甲基化能夠導致α-Syn的高表達[9, 11, 12]。這些結果提示，CpG島的甲基化程度參與人調控α-Syn的表達，并與PD的發生相關聯。研究還顯示，正常腦組織中，該CpG島在皮層、紋狀體、黑質中均高度甲基化；而PD患者腦組織中，該CpG島在皮層、紋狀體高度甲基化；在黑質中幾乎不存在甲基化[9]。這一結果提示該CpG島的甲基化可能與PD中多巴胺能神經元特異性損傷相關。嚙齒類動物中，α-Syn內含子1區段同樣發揮著重要的轉錄調控作用，并且該區段同樣富含CpG位點[13]。目前仍不明確，小鼠α-syn的轉錄是否也受內含子1區段甲基化水平調控。闡明這一問題將有助于解析PD小鼠模型與PD患者間的異同，有助于輔助正確解讀基于PD小鼠模型的研究成果。本研究分析了小鼠α-Syn內含子1的CpG島，建立了定量分析其甲基化水平的檢測方法，檢測了不同腦區小鼠α-Syn基因CpG島甲基化水平。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級C57BL/6雄性小鼠，2月齡10只，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2011-0004。飼養條件：每日光照12 h，黑暗12 h，室溫23℃，任意攝取水食。相同時間全部處死后取小鼠新鮮腦組織并按解剖結構分離皮質、海馬、紋狀體及中腦并凍存于-80℃待用。實驗全過程對動物的飼養與取材均遵守實驗動物管理與保護的有關政策和規定。

1.2 主要試劑和儀器

QIAamp DNA mini試劑盒(德國Qiagen公司)，Wizard DNA純化試劑盒(美國Promega公司)，HS Taq (日本Takara公司)，PyroMark gold Q96 reagents(德國Qiagen公司)，Streptavidin SepharoseTMBeads(美國GE公司)，Nanodrop 2000分光光度計(美國Thermo公司)，PTC-l00基因擴增儀(美國MJ research公司)，PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀(德國Qiagen公司)。

1.3 基因組DNA的提取和偏重亞硫酸氫鹽處理

按照QIAamp DNA mini試劑盒說明書提取凍存的不同腦區小鼠組織基因組DNA。使用偏重亞硫酸氫鈉和對苯二酚對基因組DNA進行處理,通過該處理，未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。處理過程如下，1 μg基因組DNA使用0.3 mol/L的NaOH進行變性。而后使用新鮮配置的偏重亞硫酸氫鈉(終濃度3.0 mmol/L, pH 5.0)與對苯二酚的混合溶液(終濃度0.5 mmol/L, pH 5.0)與基因組DNA混合，石蠟油覆蓋，避光50 ℃孵育16 h。繼而使用Wizard DNA 純化試劑盒純化DNA。最后加入0.3 mol/L的NaOH在37 ℃孵育15 min結束反應，并乙醇沉淀。

1.4 小鼠α-syn內含子1區段CpG島分析

使用在線軟件MSPPrimer (http://www.mspprimer.org/cgi-bin/design.cgi)[14]分析小鼠α-syn基因內含子1及其側翼序列。

1.5 焦磷酸測序引物設計

使用PyroMark assay design 2.0(德國Qiagen公司)設計擴增引物和測序引物。正向擴增引物為：5’-GGGGAGAGGAGTTGATAAATTAGTTG-3’；反向擴增引物使用Biotin標記：5’- TCCTAATTTCCCC AATCTAATTTCA-3’；測序引物為：5’-GTGAAGG AGTTAGGGA-3’。引物由上海生工生物技術有限公司合成。擴增產物長度160 bp，可以定量分析3個CpG位點的甲基化水平。待分析序列為：GTTAGAGYGTTYGGTAGTAGGTAGTAGAYGGTA，其中Y代表CpG位點。

1.6 聚合酶鏈反應

經亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為模板，使用HS Taq進行擴增。擴增條件為：94℃預變性2 min； 94℃變性20 s，58℃退火20 s， 72℃延伸20 s，共50循環；最后72℃延伸5 min。

1.7 焦磷酸測序(Pyrosequencing)

將生物素標記的PCR產物與親和素標記的微珠相混合，利用真空預處理裝置使分離純化生物素標記的單鏈DNA，轉移入PyroMark Q96 ID測序儀中。生物素標記的單鏈DNA作為模版，使用0.6 μmo/L測序引物，按照PyroMarkQ96使用說明書進行測序操作。

注：(A)小鼠內含子1及其側翼區域。其中上層方框代表外顯子，上層直線代表內含子1；中層灰框代表CpG島區域，灰框上方灰色豎條代表內含子1中的CpG位點；下層雙箭頭直線為焦磷酸測序擴增的區域。(B)焦磷酸測序示意圖，其中灰色區域為CpG位點，藍底數字顯示每個位點的甲基化百分比。

2 結果

小鼠α-syn基因內含子1長度為674 bp，連同其上下游的外顯子1和2共計1 131 bp。經在線軟件MSPPrimer分析，與人α-syn基因相似，該區段存在一個CpG島，該CpG島覆蓋了內含子1的后半段和外顯子2的大部分(圖1A)。設計焦磷酸測序檢測，擴增片斷長度為160 bp，電泳顯示擴增產物與預期片段大小一致。使用SssI 甲基轉移酶處理并經亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為模板，同樣擴增獲得160 bp 擴增子。而使用未經亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為模板，無擴增產物。表明擴增條件特異(圖2)。通過焦磷酸測序能夠定量檢測3個CpG位點的甲基化水平。焦磷酸測序結果如圖1B所示，灰色區域為CpG位點。根據焦磷酸測序中胞嘧啶的數目與胞嘧啶和胸腺嘧啶之和的數目相比即可獲得該位點甲基化百分比。每個CpG位點的甲基化百分比由儀器自動計算并顯示于CpG位點頂部的藍色區域。使用焦磷酸測序法對不同腦區的甲基化水平進行檢測，如圖3所示，成年小鼠皮質、中腦、紋狀體、海馬等四個腦區該CpG島平均甲基化水平均低于2%，不同腦區間無明顯差別。

注：不同小鼠腦區基因組DNA經偏重亞硫酸氫鹽處理，而后作為模板進行擴增。擴增產物160 bp。SssI甲基轉移酶處理的基因組DNA作為陽性對照，未經偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA為陰性對照。

3 討論

DNA甲基化通過調控基因表達，影響生物生理與行為，是表觀遺傳學研究的一個重要方面[15]。近年來發展和建立了多種DNA甲基化的檢測手段，最常見的是甲基化特異性PCR和克隆測序。焦磷酸測序是一種基于即時測序的技術，可以對甲基化程度進行精確定量。相比其他DNA甲基化檢測手段，焦磷酸測序操作簡便、結果重復性高也更加準確[16]。因此本研究選擇建立基于焦磷酸測序的DNA甲基化檢測方法。

多項研究均表明人α-syn內含子1區存在CpG島，人α-syn的表達受到該CpG島甲基化水平的調控，并且正常腦組織中多個腦區均呈高甲基化狀態[9-12]。我們的研究表明，盡管小鼠α-syn內含子1區也存在CpG島，但該CpG島在所檢測的四個腦區中均呈低甲基化狀態，甲基化水平均不超過2%。這一結果與人腦組織中40-100%的甲基化水平差異明顯[9]。提示小鼠腦組織中α-syn的轉錄調控機制與人類存在明顯差異。與此相吻合，人及靈長類動物腦組織中α-syn表達水平隨增齡而增加[17]，而在嚙齒類中α-syn表達量隨增齡而減少[18]。這種差異很可能與α-syn內含子1CpG島甲基化調控存在關聯。本研究對于指導選擇合適的動物和細胞模型也具有重要意義。例如，有研究顯示DNA甲基化酶抑制劑能夠上調α-syn的表達，從而加強MPP+以及6-OHDA等毒素的毒性[12]。研究者認為DNA甲基化酶抑制劑可能是治療PD的靶點。而我們的結果提示小鼠以及小鼠來源的細胞，由于其中α-syn的表達不受DNA甲基化的調控，可能不適合該項目的后續研究。

圖3 不同小鼠腦區α-syn內含子1CpG島甲基化百分比

總之，本研究建立了定量分析小鼠α-syn內含子1CpG島甲基化水平的焦磷酸測序方法。本研究還提示小鼠與人α-syn的表觀遺傳調控存在明顯差異。

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