恒河猴samhd1基因編碼區多態性及其對蛋白結構和功能的影響

熊圣文，王 衛，董志會，陳 霆，魏 強

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

SAMHD1(SAM domain and HD domain 1) 是近年來發現的對HIV-1等逆轉錄病毒復制具有明顯限制作用的天然抗病毒蛋白之一[1,2]，而在恒河猴體內也存在抑制猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)復制的samhd1基因[3]。前期研究表明，Trim5α和Apobec3G等天然抗病毒蛋白在進化過程中，會出現影響抗病毒功能的核苷酸突變；進化分析也證實，samhd1基因部分氨基酸殘基位點可能影響Vpx對SAMHD1的敏感性[3]。但有關恒河猴samhd1基因多態性，及對蛋白結構和功能的影響尚未見報道。本研究旨在通過基因測序，序列比對，蛋白質結構預測等技術找到恒河猴Samhd1基因中影響抗SIV功能的cSNP位點，從而為探索SAMHD1抗病毒機制和優化SIV/SHIV/恒河猴模型提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與樣品采集

中國恒河猴138只，購自北京協爾鑫生物資源研究所(合格證編號：SCXK(京)2005-2005)；分別采集動物外周血1 mL，EDTA抗凝，樣品采集后4 h內提取RNA。

1.2 外周血RNA的提取及反轉錄

實驗猴EDTA抗凝全血使用RNA blood mini kit(購自Qiagen公司)進行總RNA的提取，提取過程參照試劑盒說明書；提取RNA后立即對其進行反轉錄。

1.3 RT-PCR擴增

Samhd1基因擴增采用巢式PCR，第一輪RT-PCR使用One Step RNA PCR Kit (AMV)(TaKaRa，大連)進行，操作過程參照試劑盒說明書；第二輪PCR使用KOD-Plus試劑盒(TOYOBO, 上海)進行，操作過程參照試劑盒說明書。Samhd1基因引物由引物設計軟件Primer Premier 5.0設計完成，由Invitrogen公司合成。外套引物序列為：outer-F 5′-CCC GAA GGG CTC AAC TGT CA-3′; outer-R 5′-AGA CTT TAA TAA TAC TAA AAA TAG GCA AGG-3′，退火溫度為44.5℃。內套引物序列為：inner-F 5′-CAA TAC TGC TTG GAC TCC CCG CC-3′；inner-R 5′-ATT CTA GGA GTG AAG CCC CTA AAT GAA TT-3′，退火溫度為51℃。PCR在System 9700 PCR儀上進行(Applied Biosystems公司)。

1.4 序列比對和生物軟件分析

DNA測序由北京諾賽基因公司完成。利用DNAstar軟件進行核苷酸和氨基酸序列比對[4]，標準恒河猴[Macacamulatta] SAMHD1 cDNA序列為：NM_001271642.1；標準恒河猴[Macacamulatta] SAMHD1氨基酸序列為：NP_001258571。

分別用Predictprotein、SWISS-MODEL軟件進行蛋白質二級和三級結構的預測。

1.5 SNaPshot分型檢測

SNP的分型檢測采用SNaPshot技術，即基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術。該檢測過程交由北京閱微基因公司，基于3730XL平臺完成。

2 結果

2.1 中國恒河猴Samhd1基因編碼區cSNP位點的分布

提取29只恒河猴全血RNA，逆轉錄PCR后進行測序比對(參照序列為NCBI上公布的Samhd1 cDNA序列，NP_001258571)，一共找到11個突變位點，分別位于基因的N端、SAM結構域、鏈接區、HD結構域和 C端(表1)；通過使用DNAstar軟件進行翻譯和氨基酸序列比對，發現其中5個突變位點為非同義突變，在Samhd1編碼區上的位置分別是：15 bp (C/G)、 320 bp (C/T)、 547 bp (G/A)、 552 bp (A/T)、839 bp (T/C)[5](圖1)。其中G183S、E184D、V280A分布在HD結構域上；S107L分布在SAM結構域上；D5E分布在N端非結構域上。

2.2 非同義cSNP對SAMHD1蛋白二級結構的影響

Predictprotein軟件分析結果顯示，5個非同義cSNP位點突變影響了SAMHD1蛋白的二級結構，具體的，在264aa位置附近一個α螺旋結構變成β片層，530aa附近增加了一個α螺旋。295aa附近的蛋白質結合位點移動到540aa附近，其它結構均未發生變化(圖2，見彩插1)。但當單獨出現280aa或 183aa和184aa的突變時，軟件分析結果顯示并不引起此二級結構變化(圖未列出)。

圖1 恒河猴SAMHD1的蛋白質結構及SNP分布情況

表1恒河猴samhd1基因突變位點

Tab.1samhd1 nucleotide mutants of the rhesus macaques

結構域突變位點(bp)核苷酸突變氨基酸位置(aa)氨基酸突變N端15C->G5D-E(天冬氨酸-谷氨酸)SAM區168C->T56/320C->T107S-L(絲氨酸-亮氨酸)鏈接區396C->T 132/528G->A176/HD區547G->A183G-S(甘氨酸-絲氨酸)552A->T184E-D(谷氨酸-天冬氨酸)839T->C280V-A(纈氨酸-丙氨酸)1125A->G375/C端1692C->G 564/1752C->T584/

2.3 非同義cSNP對SAMHD1蛋白功能的影響

為預測cSNP對SAMHD1蛋白功能的影響，使用SWISS-MODEL軟件對SAMHD1蛋白不同結構域進行結構預測。

圖3A所示samhd1基因SAM結構域的三級結構分析圖，綠色標出文獻中通過進化分析找到的影響Vpx對SAMHD1敏感性的位點，其中，包括紅圈中的S107L位點，說明S107L影響病毒Vpx蛋白對SAMHD1的敏感性。

圖3B為samhd1基因HD結構域的三級結構分析圖，可以看到G183S、E184D、V280A三個位點均分布在蛋白質表面，且和文獻中已知的重要位點(綠色標出)距離較遠，其中V280A處于蛋白質活性中心(凹槽部位)的袋口處，類似于盒蓋的結構上，可能會影響到SAMHD1的脫氧核苷酸三磷酸水解酶催化活性；而G183S、E184D兩個位點均分布在凹槽的背面，但文獻中報道的一些可能影響Vpx對SAMHD1敏感性的位點也位于類似位置(如圖3B“凹槽”下方的綠色位點)，所以不能排除G183S、E184D兩個位點會影響SAMHD1與Vpx結合的可能性(圖3見彩插1)。

2.4 基因分型及cSNP位點的頻率測定

根據發現的核苷酸有義突變位點，利用SNaPshot技術對138只中國恒河猴進行了基因分型并驗證是否為cSNP位點。通過SNaPshot檢測，發現138只中國恒河猴中C15G基因頻率占2.17%；C320T的基因頻率為6.88%；G547A的基因頻率為13.41%；A552T的基因頻率為4.35%；T839C的基因頻率為17.39%，這5個位點均可判定為SNP(基因頻率大于1%)。另外還發現G547A和T839C存在較強的連鎖關系，連鎖頻率占21.01%。對基因分型結果進行分析，本實驗共找到了6種突變基因型(根據5個cSNP在基因中的前后順序，將正常基因型表示為：… C…C…GA…T…)，詳情見表2。

表2 恒河猴samhd1突變基因型及比率

3 討論

SAMHD1主要在單核細胞、單核細胞來源的巨噬細胞、樹突狀細胞等髓系細胞以及靜息CD4+T細胞中表達[1]。SAMHD1具有磷酸水解酶活性，受dGTP的調控，它對HIV-1復制的限制是通過降解細胞內dNTP的水平[6,7], 使胞內dNTPs的水平低于病毒復制的需要水平，從而切斷HIV-1逆轉錄所需底物的來源；這一過程被稱為“核苷酸倉庫耗竭”。 研究發現SAMHD1對HIV-1 的復制具有明顯的限制作用，但可以被HIV-2和SIV編碼的Vpx蛋白拮抗[2]。另外，有些Vpr蛋白也能起到類似作用[3]。2011年，Powell et al通過功能實驗找到了20多個與SAMHD1蛋白功能有關的氨基酸殘基位點[8]。2012年，Lim et al通過正向選擇分析找到6個氨基酸殘基位點可能影響Vpx對SAMHD1的敏感性[3]。因此，氨基酸殘基位點的突變對于SAMHD1的抗病毒功能將可能產生很大影響。

非同義cSNP堿基序列的改變可使以其為模板翻譯的氨基酸序列發生改變，從而影響蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。因此，本研究主要分析了SAMHD1分子的編碼區非同義SNP位點。

和人類相似，在進化過程中恒河猴SAMHD1分子上也存在著大量的SNP位點。 2012年，Coon et al在分析人samhd1基因多態性時，發現SNP (rs1291142)與SAMHD1表達量顯著相關[7]。因此，我們對恒河猴SAMHD1分子的編碼區突變情況進行了大樣本的篩查，總共有5個位點被鑒定為非同義cSNP，在群體中均占有較高的頻率，其中G183S、E184D、V280A分布在具磷酸水解酶活性的HD結構域上；S107L分布在參與蛋白-蛋白或蛋白-RNA 相互作用的SAM結構域上。

為了判斷這些cSNP是否能影響到蛋白質的功能，我們先進行了蛋白高級結構和功能預測分析。用軟件對SAMHD1二級、三級結構的分析發現，5個cSNP中G183S、E184D、V280A三個位點最有可能影響蛋白質的功能和結構，在二級結構上，這三個位點所處的HD結構域發生了一個α螺旋到β片層的轉變，一個蛋白質結合位點也因為這三個cSNP的出現而發生了移位；在三級結構上，V280A正好處于蛋白質活性中心(凹槽部位)的袋口處，類似于盒蓋的結構上，可能會影響到SAMHD1的磷酸水解酶催化活性。另外，發現S107L與文獻中報道的可能影響病毒Vpx蛋白對SAMHD1敏感性的位點重合，說明此位點也有較大可能會改變蛋白質的功能。D5E未分布于重要的蛋白結構域上，目前還沒有能改變蛋白功能的證據支持，但也有文獻報道，SAMHD1蛋白的N端能夠與艾滋病毒相互作用，所以有待進一步的實驗驗證。如果實驗驗證這些位點與抗病毒功能有關，則說明該蛋白與SIV在相互進化過程中發生了選擇作用。

這些分析為之后蛋白功能實驗提供了大量的參考依據，同時也為SAMHD1抗病毒機制的進一步研究發掘了新的靶點。我們后續還將分別對在SAMHD1上發現的6種基因型進行蛋白功能實驗驗證。

參考文獻：

[1] Baldauf HM, Pan X, Erikson E, et al.SAMHD1 restricts HIV-1 infection in resting CD4(+) T cells [J]. Nat Med, 2012， 18(11):1682-1687.

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[3] Lim ES, Fregoso OI, McCoy CO, et al. The ability of primate lentiviruses to degrade the monocyte restriction factor SAMHD1 preceded the birth of the viral accessory protein Vpx [J]. Cell Host Microbe, 2012， 11(2):194-204.

[4] 劉克劍, 叢喆, 金光, 等. 表現神經癥狀的SIVmac251感染猴大腦基底節病毒gp120序列變異分析 [J].中國實驗動物學報, 2012, 2:37-42.

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[6] Powell RD, Holland PJ, Hollis T, et al. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase [J]. J Biol Chem, 2011， 286(51):43596-43600.

[7] Goldstone DC, Ennis-Adeniran V, Hedden JJ, et al.HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase [J]. Nature, 2011， 480(7377):379-382.

[8] Coon S, Wang D, Wu L. Polymorphisms of the SAMHD1 gene are not associated with the infection and natural control of HIV type 1 in Europeans and African-Americans [J]. AIDS Res Human Retroviruses, 2012, 28(12): 1565-1573.