安全劑cyprosulfamide對煙嘧磺隆的解毒作用

劉小民， 張宏軍， 李秉華， 鈕麗娜， 王貴啟

(1.河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035；2.農業部農藥檢定所，北京 100125)

煙嘧磺隆(nicosulfuron)，中文名稱為2-(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰)N，N-二甲基煙酰胺，是日本石原產業株式會社開發的玉米田磺酰脲類除草劑[1]。煙嘧磺隆殺草譜廣，具有較好的莖葉處理活性，除草效果突出，尤其對玉米田惡性禾本科雜草有較好的防除效果，因而在生產上被大面積推廣應用。隨著煙嘧磺隆使用面積的大幅度上升，其藥害問題也日益突出，近年來不斷有關于煙嘧磺隆對玉米造成藥害的報道。陶波等研究表明：玉米不同類型品種間對煙嘧磺隆耐性差異明顯，其中爆裂型玉米對煙嘧磺隆最為敏感[2]。董曉雯等研究表明：32種供試玉米品種中的7個品種對煙嘧磺隆較敏感，60 g a.i./hm2處理下，施藥13 d后對敏感型玉米品種的鮮重抑制率高達65.59%[3]。煙嘧磺隆對玉米產生藥害的癥狀主要表現為：玉米葉片出現不規則褪綠斑，嚴重時葉片卷縮成筒狀，葉緣皺縮，心葉呈牛尾狀，不能正常抽出，植株矮化，有時會產生叢生、次生莖[4-5]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑：95.5%煙嘧磺隆原藥(滄州科潤化工有限公司)；cyprosulfamide(Sigma公司)；1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)、聚乙烯聚吡咯唍酮(PVPP)及還原型谷胱甘肽(GSH)、牛血清白蛋白(BSA)，均購自上海生工生物工程有限公司。

供試玉米12HB02由河北省農林科學院糧油作物研究所玉米研究中心提供，試驗土壤取自河北省農林科學院糧油作物研究所堤上試驗站1～15 cm無污染的耕層土壤，過篩、自然風干后使用。土壤pH值為7.10，有機質含量為2.07%。

1.2 cyprosulfamide對煙嘧磺隆的解毒效果試驗

將精選的玉米種子均勻播種于裝有營養土的盆缽中(高10 cm、直徑11 cm)，采用底部滲灌方式，使盆缽中的土壤完全濕潤，然后覆土1.0 cm后置于溫室苗床上。待玉米培養至3葉1心期，每盆定苗至3株。煙嘧磺隆處理濃度分別為30、60、90 g a.i./hm2，cyprosulfamide添加比例分別為 1 ∶0.2、1 ∶1、1 ∶5。噴藥器械為ASS-1型農藥噴灑系統，XR8003扇形噴頭，噴霧壓力為0.3 MPa，噴藥量為 400 L/hm2。施藥14 d后測量各處理玉米株高及地上部分鮮重。每個處理設3次重復，數據采用DPS7.0軟件進行處理和方差分析。

1.3 谷胱甘肽轉移酶(GST)酶液制備及活性測定

施藥3 d后，取玉米葉片1.0 g，液氮速凍后，研磨成粉末，然后向其中加入3 mL GST酶提取液(含1 mmol/L EDTA、14 mmol/L 巰基乙醇、75 g/kg聚乙烯吡咯烷酮的0.1 mol/L pH 值7.5 Tris-HCl緩沖液)。4 ℃下15 000g離心20 min，所得上清液即為待測酶液。

參照Habig等試驗方法[8]，稍做修改，向含有 30 μL 100 mmol/L CDNB、30 μL 100 mmol/L GSH的0.1 mol/L pH值6.5的PBS溶液900 μL中加入100 μL酶液，共計1 mL體系，對照加入100 μL PBS溶液，25 ℃水浴中保溫10 min后，置于比色皿中，記錄340 nm處吸光度在5 min內的變化，每隔1min讀數1次。

GSTs活力單位(μmol/min)=(ΔD340 nm·V)/(ε·L)

式中：ΔD340 nm為每1 min 340 nm處吸光度的變化值，V為酶促反應體積(3 mL)，ε為產物的消光系數[0.009 6 L/(μmol·cm)]，L為比色杯光程(1 cm)。

GST比活力[μmol/(min·mg)]= 酶活力單位/測定所用酶蛋白量。

蛋白定量測定參照Bradford的考馬斯亮藍 G-250 法[9]。

2 結果與分析

2.1 cyprosulfamide減輕煙嘧磺隆對玉米生長影響的作用

由表1可以看出，隨著煙嘧磺隆處理濃度的增大，對玉米株高及鮮重的抑制率逐漸增大。煙嘧磺隆30、60、90 g a.i./hm2處理下，對玉米株高的抑制率分別為18.10%、21.28%、37.75%，對玉米鮮重的抑制率分別為34.97%、42.97%、62.73%。添加不同比例cyprosulfamide之后，減輕了煙嘧磺隆對玉米株高、鮮重的抑制。煙嘧磺隆處理濃度相同，添加不同比例cyprosulfamide各處理之間對煙嘧磺隆的解毒效果存在差異。當煙嘧磺隆處理濃度為 30 g a.i./hm2時，cyprosulfamide添加比例為1 ∶0.2對其解毒效果最好，對玉米株高、鮮重的抑制率分別為13.68%、23.92%，分別比30 g a.i./hm2煙嘧磺隆處理降低4.42、11.05百分點。當煙嘧磺隆處理濃度為60 g a.i./hm2時，cyprosulfamide添加比例為1 ∶1對其解毒效果最好，對玉米株高、鮮重的抑制率分別為17.44%、31.65%，分別比60 g a.i./hm2煙嘧磺隆處理降低3.84、11.32百分點。當煙嘧磺隆處理濃度為90 g a.i./hm2時，cyprosulfamide添加比例為1 ∶5對其解毒效果最好，對玉米株高及鮮重的抑制率分別為18.43%、33.55%，分別比90 g a.i./hm2煙嘧磺隆處理降低19.32、29.18百分點。

表1 煙嘧磺隆處理中添加不同比例cyprosulfamide對玉米株高及鮮重生長的影響

2.2 cyprosulfamide對玉米體內GST活性的影響

圖2為煙嘧磺隆添加不同比例安全劑cyprosulfamide對玉米體內谷胱甘肽轉移酶活性的影響。結果表明，煙嘧磺隆不同處理誘導玉米體內GST活性的增加。當煙嘧磺隆的處理濃度為30、60、90 g a.i./hm2時，玉米體內GST比活力活性分別為0.911、1.220、0.969 μmol/(min·mg)，分別比對照的0.827 μmol/(min·mg)增加10.3%、47.8%、17.3%。添加不同比例cyprosulfamide后，玉米體內GST比活力均有所增加。煙嘧磺隆處理濃度為 30 g a.i./hm2時，cyprosulfamide添加比例為 1 ∶0.2、1 ∶1、1 ∶5，玉米體內GST比活力分別為1.224、1.131、1.102 μmol/(min·mg)，分別比煙嘧磺隆單獨使用增加34.4%、24.2%、21.0%。煙嘧磺隆處理濃度為60 g a.i./hm2時，不同比例cyprosulfamide處理玉米體內GST比活力分別為1.547、1.582、1.388 μmol/(min·mg)，分別增加了26.8%、29.7%、13.7%。煙嘧磺隆處理濃度為 90 g a.i./hm2時，不同比例cyprosulfamide處理玉米體內GST比活力分別為1.142、1.313、1.277 μmol/(min·mg)，分別增加了17.9%、35.6%、31.8%。GST比活力的增加，進一步催化谷胱甘肽與煙嘧磺隆發生軛合，從而減輕了煙嘧磺隆對玉米生長的影響。

3 結論與討論

安全劑的作用機制在過去幾十年來一直受到人們的廣泛關注，但明確的作用機制仍未闡明。相似結構活性理論(QSAR)、谷胱甘肽軛合論以及細胞色素P450單氧化酶催化的羥基化理論是最為普遍的機制解釋[10-12]。其中谷胱甘肽軛合論指出安全劑主要通過增進還原型谷胱甘肽含量及提高谷胱甘肽轉移酶的活性來軛合除草劑的有毒代謝物，從而減輕或消除其毒害。Tan等研究了 MG-191 對玉米內乙草胺代謝的影響，發現玉米經安全劑 MG-191 處理后體內的GSH含量提高了30%，GST酶的活性提高了34%[13]。葉非等研究證實安全劑AD-27能夠提高單嘧磺隆處理后的高粱幼苗中的GSH含量， 促進單嘧磺隆與GSH的軛合作用，從而緩解單嘧磺隆對高粱產生的藥害[14]。本研究結果表明，添加不同比例安全劑cyprosulfamide后，玉米體內GST比活力均有所增加。當煙嘧磺隆處理濃度不同時，要減輕煙嘧磺隆對玉米生長的影響，所需要添加的安全劑cyprosulfamide比例不同。低濃度的煙嘧磺隆處理需要添加cyprosulfamide的比例較小，而當煙嘧磺隆濃度增大后，需要添加安全劑的比例也需要相應增大。葉非等研究指出，只有當安全劑AD-67與單嘧磺隆濃度為一定配比時，才能較好地起到保護作物免受除草劑藥害的作用[14-15]，與本研究結果類似。

安全劑是除草劑研究的一個分支，具有廣闊的發展前景及開發應用市場。由于安全劑的作用機理還不十分清楚，因此今后需要利用生物化學、植物生理學及分子生物學等知識進一步從分子水平上研究安全劑的作用機理，并對除草劑、安全劑、作物三者之間的相互作用機制進行研究。

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