Ⅳ型膠原多克隆抗體的制備及性質研究

吳鵬等

[摘要]目的 通過免疫母雞制備抗人Ⅳ型膠原多克隆抗體（IgY），為檢測人血清Ⅳ型膠原含量提供IgY。 方法 采用人胎盤來源的Ⅳ型膠原蛋白作為抗原，免疫Leghorn母雞，采用PEG方法分離純化雞卵黃中的抗體，獲得抗體粗提物。經Sephadex G100凝膠過濾制備多克隆抗體純品。使用SDS-PAGE、免疫瓊脂雙向擴散等方法對提取物的含量、純度及特異性進行鑒定。 結果 電泳結果顯示，抗體粗提物純度為81%。抗體純品僅在70kd和25kd處各有一條帶，純度達到96%；免疫瓊脂雙向擴散實驗結果顯示，抗體純品、粗品及免疫三周后雞血清均與中心孔的抗原形成抗原抗體復合物的乳白色沉淀線。 結論 本研究分離純化方法制備的抗Ⅳ型膠原IgY，具有抗體純度高、特異性強等特點，為多克隆抗體廣泛應用奠定了基礎。

[關鍵詞] IgY；Ⅳ型膠原；多克隆抗體

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）10-27-04

[Abstract] Objective To detect the content of collagen type Ⅳ in human serum， and prepare polyclonal antibody （IgY） against it by immunized hens. Methods The collagen typeⅣ from human placenta was used as antigen to immunize Leghorn hens. It was used the PEG method to prepare antibody-IgY from the chicken egg yolk and obtain its crude extraction. The purity of the polyclonal antibody（IgY） was obtained by Sephadex G-100 gel filtration column. The content， purity and specificity of extract were measured with SDS-PAGE and double agar gel immune-diffusion test. Results The result of electrophoresis showed that the purity of antibody crude extraction was 81%， The purified IgY were shown two straps and the molecular weight（MW） of them were estimated to be approximately 70kD and 25kD respectively， its purity was 96%； the result of double agar gel immune-diffusion test showed that such as the purification and crude extraction of antibody and chicken sera after immunization three weeks， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen in the center hole. Conclusion In this study， the IgY against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which afford a theoretical foundation for polyclonal antibodies widely application.

[Key words] IgY； Collagen type Ⅳ； Polyclonal antibody

近年來，用于疾病研究、診斷的抗體主要來源于哺乳動物的單克隆抗體和多克隆抗體[1]。由于多克隆抗體在制備和純化方面較單克隆抗體簡單，且可在完成一次免疫后連續獲得大量抗體。因此，多克隆抗體在疾病的診斷方面已經廣泛應用[2]。IgY是禽類血清中的主要免疫球蛋白，雞經特異性抗原免疫后，在卵黃中可富集特異性抗體（IgY）[3]。卵黃中的IgY純度高，有較強的特異性。

1.8 IgY特異性鑒定

采用免疫瓊脂雙向擴散方法[7]。1.2%鹽水瓊脂糖制備瓊脂板；待瓊脂凝固后，打孔器打孔，孔徑 4mm，孔距 15mm；加樣，1孔加生理鹽水對照、2孔加入抗體純品、3孔加抗體粗品、4孔加入血清（雞免疫后3周），每孔加樣品20μL；瓊脂板玻片置 37℃溫箱中 12h。的輕鏈，IgY重鏈區有4個穩定區而區別于其他抗體的3個穩定區，報道稱IgY的分子量為180kd[9]。目前關于IgY制備技術趨于成熟，具備方法簡單、一次免疫后持續獲得大量抗體的特點。關于IgY的分離純化方法很多，包括聚乙二醇（PEG）法、水稀釋法、氯仿-PEG法等[10]。

本研究為獲得純度較高的Ⅳ型膠原IgY，采用PEG法與Sephadex G100凝膠過濾相結合的方法制備多克隆抗體。結果顯示，純化的抗體經SDS-PAGE電泳可見單純PEG法分離的抗體（粗品），在70kd以上、25kd以下均有少量雜帶，圖像分析儀檢測純度為81%。經EPG與凝膠過濾聯合方法制備的抗體（精品），僅在25、70kd處有兩條帶，其他位置未見多余條帶，純度為97%。抗體含量檢測結果，粗品含量為46.87mg、精品含量為33.22mg。按照純度的百分比計算，可見精品的抗體含量與粗品中抗體含量基本符合，同時也證明經凝膠過濾后，抗體含量基本沒有丟失。IgY特異性鑒定結果表明，抗體精品、抗體粗品、血清與抗原間均有特異性沉淀線產生，而且線的連接平滑、無交叉，證明三個樣品中的抗體與中心孔的抗原有特異性，并表明三種抗體來源相同[11]。按照第2-3-4孔的順序，抗原抗體復合物形成沉淀線逐漸遠離中心孔，這是由于各孔中抗體含量逐步降低的結果[12]。中心孔與1孔之間沒有沉淀線產生。

Ⅳ型膠原蛋白是基底膜網狀結構的主要成分，肝臟纖維化時，肝組織和血清內Ⅳ型膠原含量隨纖維化程度而增加。因此，檢測血清中Ⅳ型膠原含量可以早期診斷肝纖維化及病變程度[12]。目前，檢測的方法有化學發光法、酶標記法（ELISA）等。采用本研究分離純化方法制備的抗Ⅳ型膠原IgY，具有純度好、含量高、抗體特異性強的特點，符合診斷試劑對多克隆抗體的要求[13]，為建立新型檢測方法奠定了基礎。

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（收稿日期：2014-03-14）