大蒜素對貝赫切特病的治療作用及機制探討*

鐘建橋 ，先德海 ，廖勇梅

(1.瀘州醫學院附屬醫院皮膚科,四川瀘州 646000，2.瀘州醫學院解剖教研室，四川瀘州 646000)

·論 著·

大蒜素對貝赫切特病的治療作用及機制探討*

鐘建橋1，先德海2，廖勇梅1

(1.瀘州醫學院附屬醫院皮膚科,四川瀘州 646000，2.瀘州醫學院解剖教研室，四川瀘州 646000)

目的 探討大蒜素對實驗性貝赫切特病(BD)的治療作用及機制。方法 構建BD模型鼠，將其分為實驗組、陽性對照組和陰性對照組，分別鼻飼注入大蒜素、秋水仙堿和生理鹽水。肉眼觀察治療前后皮損的變化，ELISA法檢測治療前后血清γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-4和化學比色法檢測總抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷甘肽過氧化物酶(GSH-PX)。結果 模型小鼠背、腹、陰部出現潰瘍，IFN-γ、TNF-α、IL-4和MDA升高，T-AOC、SOD和GSH-PX下降。治療20 d后實驗組和陽性對照組小鼠潰瘍基本愈合；30 d后實驗組僅2只復發，陽性對照組有6只復發，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后實驗組IFN-γ、TNF-α和IL-4較治療前降低(P<0.01)，與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組T-AOC、SOD和GSH-PX較治療前升高，MDA下降 (P<0.01)，與陽性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 大蒜素是治療實驗性BD的有效藥物，可能是通過抑制炎癥因子、阻止氧化應激而作用。

貝赫切特綜合征；大蒜素；免疫反應；氧化應激

貝赫切特病(Behcet′s disease,BD)是一種慢性炎癥性多系統性血管炎，可累及皮膚黏膜、眼部等多個系統，迄今為止無滿意療法。盡管BD的確切機制不清，但大多認為與遺傳、感染、免疫及氧化應激等有關，而免疫紊亂和氧化應激在其發病中起了重要作用[1-2]。大蒜素來源于大蒜，具有調節免疫、抗氧化、抗感染等作用，為BD的治療帶來新希望[3]。盡管大蒜素已被廣泛應用于多種疾病，但在BD中的治療研究目前尚未見報道。本研究通過構建BD動物模型來觀察大蒜素的治療效果，同時檢測血清中免疫炎癥因子γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-4和氧化應激相關指標總抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷甘肽過氧化物酶(GSH-PX)以探討大蒜素的治療機制，為BD臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 動物為4～5周大小的健康雄性ICR小鼠，共40只，平均體質量約25 g，由瀘州醫學院實驗動物中心提供；Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)購自武漢病毒研究所；大蒜素(江蘇正大清江制藥有限公司)；秋水仙堿片(云南植物藥業有限公司)。UV-1800pc紫外分光光度計(Mapada)、MODER-680酶標測試儀(Bio-Rad，美國)、低溫冰箱、超凈工作臺和電熱恒溫鼓風干燥箱等。IFN-γ、TNF-α、IL-4、T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX試劑盒均購自美國Millipore試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 構建BD動物模型 選取40只健康雄性ICR小鼠，分為兩組：模型組30只、健康對照組10只。參照文獻[4]用針刺破小鼠耳垂，然后注入Ⅰ型HSV 1.0×106 U/mL，10 d 1次，共2次，16周后模型組小鼠均造模成功。健康對照組不作任何處理。造模期間密切觀察皮損的變化，并進行攝像。小鼠在室溫20～22 ℃、12 h循環光照(每天早晨8:00開始)條件下進行喂養。

1.2.2 藥物配制、實驗分組與治療 (1)藥物配制：將20 mg/片的大蒜素以生理鹽水稀釋配制成濃度為25 μg/mL；秋水仙堿片(1 mg/片)以生理鹽水稀釋濃度為2 μg/mL。(2)分組：將造模成功的BD模型小鼠分為實驗組、陽性對照組和陰性對照組，每組各10只，分別注入大蒜素、秋水仙堿和生理鹽水。(3)治療方法：實驗組每只以1 mL/d的劑量(即25 μg)經鼻飼管注入大蒜素溶液，每天1次，連續20 d；應用相同方法對陽性對照組每只注入秋水仙堿1 mL/d(即2 μg)，陰性對照組每只注入相同量(1 mL/d)的生理鹽水。

1.2.3 指標檢測 肉眼觀察治療前后鼠皮損變化：分別觀察治療前、治療結束后以及繼續喂養10 d后鼠、皮損的變化及復發情況。細胞因子和氧化應激指標：治療前和治療20 d后分別抽取小鼠晨起空腹靜脈血。采用ELISA法檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的水平，酶標測試儀450 nm處讀數。化學比色法檢測T-AOC和MDA、SOD、GSH-PX水平，分光光度計420～630 nm讀數。均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 BD動物模型鑒定 經典模型診斷標準包括主要癥狀和次要癥狀。主要癥狀為口腔、生殖器、皮膚的潰瘍和眼部損害。次要癥狀有關節炎、胃十二指腸潰瘍和神經系統損害。病理組織變化為真皮層大量以淋巴細胞為主的炎癥細胞聚集在血管周圍。BD樣小鼠至少要出現一種主要癥狀和一種次要癥狀或病理組織變化。如達到上述標準可認為BD動物造模成功。

2 結 果

2.1 肉眼觀察動物模型的BD樣癥狀和組織病理表現 模型組在注射HSV-1 16周后30只小鼠背部、腹部和外陰處出現大小不一深在潰瘍，伴少許滲液或結痂，同時出現不同程度的四肢活動受限(關節炎)。在真皮層可見大量炎癥細胞(以淋巴細胞為主)圍繞血管周圍聚集。而健康對照組皮膚和外陰黏膜未見任何皮損，小鼠活動良好，組織病理表現正常。根據BD經典模型診斷標準，本實驗已成功構建BD動物模型30只，見圖1、2。

2.2 大蒜素等治療20 d后鼠皮損肉眼變化和30 d后復發情況 治療20 d后，實驗組和陽性對照組潰瘍完全愈合，可見粉紅色新鮮瘢痕及皮膚生長。陰性對照組而部分潰瘍增大、增深，伴膿性分泌物。治療30 d后實驗組2只小鼠背部可見一淺小潰瘍；陽性對照組6只小鼠背腹部可見散在深淺不一潰瘍；陰性對照組部分潰瘍縮小，部分出現新潰瘍。治療30 d后實驗組復發率為20%(2/10)，陽性對照組為60%(6/10)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 大蒜素等治療前后鼠血清中IFN-γ、TNF-α和IL-4水平變化 造模后模型組IFN-γ、TNF-α和IL-4表達水平較健康對照組明顯升高(P<0.01)，見表1。治療后實驗組和陽性對照組IFN-γ、TNF-α和IL-4表達水平均下降，較治療前差異有統計學意義(P<0.01)，但兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后陰性對照組IFN-γ、TNF-α、IL-4表達水平略有下降，但與治療前比較差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后實驗組和陽性對照組分別與陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖1 造模16周后模型鼠肉眼表現

圖2 造模16周后模型鼠組織病理表現(×200)表1 模型組與健康對照組血清細胞 因子水平比較

組別nIFN?γTNF?αIL?4模型組3037．51±18．03123．83±48．88116．15±37．99健康對照組304．63±1．8915．07±5．2313．21±5．05t5．71?6．96?8．47?

*：P<0.01，與健康對照組比較。

2.4 各組治療前后鼠血清中T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX表達水平變化 造模后模型組T-AOC、SOD和GSH-PX表達水平較健康對照組降低(P<0.05)，而MDA較健康正常對照組升高(P<0.05)，見表2。治療后實驗組T-AOC、SOD和GSH-PX表達水平升高，MDA下降，與治療前比較差異有統計學意義(P<0.01)；而陽性對照組治療前后比較僅SOD和GSH-PX升高明顯(P<0.05)，其余指標及陰性對照組與治療前比較無明顯變化(P>0.05)；治療后實驗組T-AOC、SOD和GSH-PX表達水平較陽性對照組和陰性對照組升高，MDA降低(P<0.05)，尤以T-AOC、MDA差異有統計學意義(P<0.01)；治療后陽性對照組與陰性對照組兩組間比較，其氧化相關指標表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

*：P<0.01，與治療前相應細胞因子比較；#：P<0.01，與陰性對照組同時間點相應細胞因子比較。

圖3 治療前后同組、治療后各組間IFN-γ、TNF-α 和IL-4表達水平比較表2 模型組與健康對照組血清氧化物水平比較±s)

*：P<0.05，**：P<0.01，與健康對照組比較。

*：P<0.01，#:P<0.05,與治療前相應指標比較；!：P<0.01，&：P<0.05,與陽性對照組同時間點相應指標比較；$：P<0.01，與陰性對照組各指標比較。

圖4 治療前后同組、治療后各組間T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX表達水平比較

3 討 論

BD是一種以血管炎為基本病變的免疫性疾病，可累及全身多系統器官，若治療不及時可發生致命性的臟器損害。盡管一些傳統藥物對BD有一定療效，但難以治愈，停藥后易復發，長期使用可能會導致嚴重不良反應[5]。而近年來采用的TNF-α抑制劑等生物制劑雖然治療BD有效，但因其潛在不良反應或昂貴的費用而應用受限[6]。大蒜素為大蒜的一種活性成分，來源豐富，價額低廉無不良反應，具有抗氧化、調節免疫等多種藥理作用，尤其在防治心血管損傷的相關研究較多[3,7]。故在大蒜素廣泛用于治療心血管疾病等安全有效的啟示下，筆者推測大蒜素亦可治療嫡屬血管炎性疾病的BD，基于這一理論基礎本研究對大蒜素在BD中的治療作用及機制進行了探討[8]。

為觀察大蒜素對BD的療效，筆者成功構建了BD動物模型，然后予以大蒜素等治療，結果發現大蒜素和秋水仙堿均能有效促進小鼠潰瘍愈合和新鮮皮膚生長。尤其在治療30 d后，且實驗組復發率僅為20%，而陽性對照組較實驗組卻有3倍的復發率，差異十分明顯。初步說明大蒜素具有促進BD潰瘍愈合，減少復發的作用。

為進一步探討大蒜素對BD的治療作用機制，本實驗又對涉及BD發生、發展的重要免疫炎癥介質和氧化應激指標進行了研究。通過檢測治療前后相關指標的表達水平發現：造模后小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-4及MDA水平明顯升高，而T-AOC、SOD和GSH-PX顯著下降，符合BD的發病過程[9-10]。經大蒜素等治療后，大蒜素和秋水仙堿能明顯降低IFN-γ、TNF-α和IL-4表達，減輕炎癥介質的釋放。同時大蒜素能顯著增強T-AOC、SOD和GSH-PX表達，減少MDA產生，較秋水仙堿能更好地上調SOD、GSH-PX活性、增強抗氧化能力、減少氧化物形成。這可能與大蒜素本身具有抗感染、抗氧化和免疫調節作用，而秋水仙堿僅有免疫抑制而無抗氧化作用等有關；同時由于大蒜素具有抗氧化作用，可阻止氧化應激損傷，秋水仙堿無此作用則使氧化應激狀態持續存在，導致損害進一步加重或反復發作，這也解釋了為什么大蒜素與秋水仙堿療效相當，但復發率較低的原因。本實驗再次證實大蒜素具有抗氧化應激損傷、減少ROS產生、抑制炎癥介質釋放的作用，這與國內外較多報道結果相一致[11-12]。此外，在實驗中發現秋水仙堿可使SOD和GSH-PX表達有所升高，但與生理鹽水比較差異無統計學意義(P>0.05)，可能與秋水仙堿抑制免疫炎癥介質釋放導致SOD和GSH-PX破壞暫時減少，使之一過性升高有關。

綜上所述，本研究發現大蒜素對實驗性BD具有治療作用，且復發率低于秋水仙堿。其作用機制可能是通過抑制BD發病中的一些重要炎癥介質的分泌和釋放，同時增強抗氧化力、減少氧化物形成，最終阻止BD組織細胞損傷。本實驗為初步探索，有待進一步臨床實驗和大樣本病例對照實驗以證實。

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To investigate the treatment and mechanism of allicin on Behcet′s disease*

ZhongJianqiao1,XianDehai2,LiaoYongmei1

(1.DepartmentofDermatology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofHumanAnatomy,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:Objective To explore the therapeutic effect and the mechanism of allicin on experimental Behcet′s disease (BD).Methods BD models were established.Then,model mice were randomly divided into experimental group,positive control group and negative control group,with respectively nasogastric infusion allicin,colchicine and saline respectively.Before and after treatment,the changes of the skin lesions were visually observed.Cytokines of IFN-γ,TNF-α and IL-4 in serum were detected by ELISA analysis,while the markers of T-AOC,MDA,SOD and GSH-PX by chemical colorimetric methods.Results After modeling,ulcers appeared on the back,abdomen and genital of model mice with IFN-γ,TNF-α,IL-4 and MDA elevation,while T-AOC,SOD and GSH-PX decrease.Twenty days of treatment later,ulcer on mice in the experimental group and positive control group healed.After 30 days,only two mice in the experimental group recurred,while 6 mice in the positive control group,which showed a significant difference between two groups (P<0.05).After treatment,IFN-γ,TNF-α and IL-4 levels in the experimental group were markedly lower than pretreatment (P<0.01),but no significant difference compared with the positive control group (P>0.05).Meanwhile,T-AOC,SOD and GSH-PX levels in the experimental group were significantly higher than those in the pretreatment,but MDA was lower (P<0.01).In comparison with the positive control group,levels of those markers in the experimental group changed remarkably (P<0.05).Conclusion Allicin is an effective drug in the treatment of experimental BD.The therapeutic mechanism of allicin may be the inhibition of inflammatory mediators and prevention of oxidative stress.

Behcet syndrome;allicin;immune response;oxidative stress

四川省衛生廳項目資助(100283)。 作者簡介：鐘建橋(1973-)，副主任醫師，博士，主要從事皮膚美容與炎癥性疾病的研究工作。

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.32.001

R758.69

A

1671-8348(2014)32-4273-03

2014-01-20

2014-04-22)