CLSM 技術在纖維表面形態和紙張結構研究中的應用

1 共聚焦激光掃描顯微鏡

與傳統光學顯微鏡不同，CLSM采用激光照射樣品的某一點并同時成像。受衍射控制的激光光點的尺寸決定了圖像的分辨率，因此，CLSM比傳統光學顯微鏡有更高的橫向 (XY向)分辨率，同時可用數字圖像處理技術改善圖像的信噪比 (S/N)和對比度。

CLSM最大的特點是可以提供“光學切片”。激光透過物鏡形成共聚焦平面，共聚焦平面以外的大部分散射光、反射光或熒光都被針孔過濾掉，不會進入光電檢測器，其成像示意圖見圖1。如果物體比較厚，則只有一個薄層可以形成清晰的圖像，即樣品橫截面的二維圖像，且針孔的過濾作用確保了圖像的信息只來源于該薄層，同時“光學切片”對樣品本身不會造成任何損傷。利用CLSM自帶的軟件，把一系列的二維圖像疊加起來，通過重組即可得到物體的三維圖像［3］。

圖1 CLSM的成像示意圖［4］

CLSM圖像的基本模型是XY平面，或樣品共聚焦面的截面。CLSM和LM的區別是:CLSM只接收共聚焦平面的信號，因此，得到的圖像僅是一個平面，而不是樣品物體的全部，但LM鏡頭內物體表面反饋的全部信號都能被接收到。CLSM通過變換沿著高度方向上的共聚焦平面，可以得到一系列的共聚焦圖像，即所謂的“光學切片”，如圖2(a)所示。借助于軟件，這些“光學切片”被疊加起來，就可以重組物體的三維圖像，如圖2(b)所示。同樣，CLSM也可掃描XZ或YZ平面。當掃描XZ平面時，可以得到沿著纖維方向上的橫切面，如圖3(a)所示;當掃描YZ平面時，可以得到纖維的橫截面，如圖 3(b)所示［5］。

圖2 桉木BCTMP漿纖維的CLSM圖［5］

圖3 纖維橫切面的CLSM圖

作為一種熒光檢測手段，CLSM觀測時需要對樣品進行熒光染色。其主要的制樣步驟如下:①配制染色劑溶液;②在避光狀態下對樣品進行充分染色;③洗掉樣品表面的浮色;④制備樣品玻片，即可進行觀察檢測。在避光保存的條件下，樣品玻片可以重復使用。

從20世紀80年代至今，CLSM的類型和功能不斷更新，已經出現了一系列的CLSM，如視屏CLSM、雙光子CLSM、4Pi共聚焦激光顯微鏡、多焦點多光子共聚焦激光顯微鏡等。本文主要圍繞傳統CLSM在纖維形態和紙張結構研究中的應用展開論述。

2 共聚焦激光掃描顯微鏡的應用

2.1 纖維的形態

紙漿纖維的形態主要包括纖維的長度、寬度、粗度、細胞壁厚度和壁腔比等指標。這些參數是評價纖維品質的重要依據，纖維品質的好壞不僅影響紙漿的品質，還直接關系到成品紙張的品質［6］。纖維長度和粗度對紙張的抗張強度、撕裂強度和耐破度有重要影響。纖維細胞的壁腔比對紙張性能的影響極大:細胞壁較厚的纖維不易打漿，纖維間的結合較差，形成的紙張物理強度性能較弱，但紙張的松厚度高，吸水性好;細胞壁薄而細胞腔大的纖維比較柔軟，容易壓潰，可以抄造出強度較高、緊度較大的紙張。運用CLSM技術進行纖維形態觀測時，首先需要對纖維樣品進行熒光染色，待熒光染料吸附到纖維表面上后洗掉多余染料，然后把樣品放在載物臺上觀察即可［7］。利用“光學切片”和圖像分析技術可以分析纖維的長度、橫截面積和細胞壁厚度等，如圖2(b)所示。

Jang等人［4］利用CLSM得到了未漂硫酸鹽針葉木漿纖維和微球體橫截面的熒光圖像。結果表明，利用CLSM技術可以對樣品的橫截面積進行定量的測量;采用微量的吖啶橙 (AO)染色可以獲得最佳的纖維共聚焦圖像;結合共聚焦技術和圖像分析技術可以測定紙漿中纖維橫截面積的大小和纖維粗度的分布。丁上駿［8］運用CLSM技術觀測化學機械漿纖維表面形態，指出打漿增加了細小纖維和纖維碎片的含量，纖維細胞壁的P層、S層逐漸被破除，纖維的長度和粗度均下降，而纖維的柔軟可塑性增加。YAN等人［9］利用ImageJ軟件把纖維橫截面的CLSM圖像進行二值化處理，得到了纖維長度、粗度和細胞壁厚度的數據，進而用于分析紙漿纖維的成紙性能。

2.2 纖維表面的木素

植物纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木素組成。在制漿過程中，利用化學或機械的方法，使纖維彼此分離。化學漿和化學機械漿有本質的區別，化學機械漿的纖維中仍保留大量的木素，對纖維本身的性能和紙漿整體質量均有負面影響，因為木素能夠降低纖維的可再濕性、柔韌性和潤脹性能，阻礙纖維間的結合以及纖維和化學品之間的連接。Koljonen等人［10］指出木素和抽出物在纖維表面呈顆粒狀或薄膜狀分布，顆粒直徑的大小與制漿方法有關，而纖維素則呈微細纖維狀分布在纖維表面。

有研究表明［11］利用CLSM技術觀測纖維表面的木素，CTMP漿纖維表面分布著大量顆粒狀物質，這些顆粒狀物質是制漿后殘存的木素或者抽出物。不論是木素還是抽出物，都具有憎水性，會阻礙纖維間的結合，降低紙張強度。丁上駿［8］利用番紅 (Safranin O)對桉木CTMP漿纖維進行染色，通過CLSM觀察打漿對纖維表面木素含量的影響。結果表明，隨著打漿轉數的增加，纖維整體和表面的熒光強度呈下降趨勢，即總木素和表面的木素含量下降，同時紙漿的抗張強度明顯提高。

當纖維與纖維之間的結合形成纖維網絡時，首先是纖維的表面相互接觸，因此，纖維表面的化學成分對纖維間的結合有更重要的影響。木素作為憎水性物質，覆蓋在纖維表面，阻隔纖維表面羥基之間的結合和氫鍵的形成，進而降低纖維間的結合強度。王寶玉等人［12］結合AFM和CLSM分析纖維表面的木素，結果表明，如果CTMP漿纖維全部為纖維素，纖維與纖維之間的作用力即纖維素間的黏附力是28.7 mN/m;而當CTMP漿纖維全部由木素構成時，木素之間的黏附力僅為2.48 mN/m;纖維表面的木素濃度是纖維整體木素濃度的兩倍;內部結合強度 (IBS)與纖維表面木素的濃度有線性關系，隨纖維表面木素覆蓋率的增加而降低。Li等人［13］利用CLSM定性分析了木素在纖維表面的分布，CLSM圖像表明未漂硫酸鹽楊木漿纖維表面的木素濃度是纖維整體木素濃度的2～3倍，而且木素在纖維表面分布不均勻，主要富集在纖維外表面、纖維壁內表面和細胞壁孔洞中。

利用CLSM觀測纖維表面的木素時，通常需要添加不同的熒光染料，如吖啶橙、天青B、黃連素和孔雀綠等，其中吖啶橙熒光效果最佳［14-15］。丁上駿等人［8］用星藍和番紅分別標記纖維上的纖維素和木素，結果表明，CTMP漿纖維中的纖維素主要集中在纖維內部，而纖維細胞壁外表面以及細胞內腔表面的木素含量都比細胞內腔的高。同時也可以利用不同的熒光染料對不同的紙漿纖維進行熒光染色，如圖4所示［16］。

圖4 漂白麥草漿和桉木高得率漿纖維分布的CLSM圖

2.3 纖維的形變性

在紙漿纖維的諸多特性中，纖維的柔韌性是纖維最重要且最基礎的一個性質。在紙張成形過程中，纖維的柔韌性會影響纖維內部的網絡結構，決定了紙張的大部分性質，如紙張的松厚度、透氣度、不透明度、表面粗糙度和物理強度等［17］。Steadman等人［18］的研究指出，紙張的緊度和纖維的柔韌性有良好的線性關系，更重要的是當纖維比較挺硬時，紙張的緊度隨纖維柔韌性的變化會更加敏感。因此如果利用機械漿代替硫酸鹽漿進行生產，機械漿纖維的柔韌程度就變得尤為重要。機械漿的添加可以降低生產成本，提高紙張松厚度，但其較差的柔韌性會限制纖維之間的結合，容易導致紙張表面粗糙［19］。

纖維的柔韌性是影響纖維內部結合強度的重要因素，決定著紙張的強度性能。Steadman等人［18］提出利用纖維的適應性能可以評價纖維的柔韌性。Li等人［5］借助于CLSM對纖維的形變圖進行掃描，如圖5所示。用數學軟件Matlab加工處理，通過低通濾波器使CLSM圖平滑化，最后轉化為二值化圖像，這樣既可以提高測量的精確度又避免了主觀誤差。由圖5可以看出，LM測量的是纖維和載玻片表面的接觸點到支撐線中心的距離L'，CLSM可以測量纖維中軸線的最低點到支撐線中心的距離L，且二者的測量結果相差較大。與化學漿纖維相比，機械漿纖維更加挺硬，纖維壁更厚，如果采用Steadman理論計算纖維的柔韌性，同時不能忽略機械漿細胞壁的厚度，那么需要測量的應該是纖維中軸線最低點到支撐線中心的距離L。實驗結果表明，CTMP漿纖維的柔韌性與纖維間的結合強度和紙張的抗張強度有很好的相關性，漂白和打漿可以增加纖維的柔韌性。

圖5 纖維橫截面的二值化圖

在紙張生產過程中，壓榨、干燥和壓光等操作會引起纖維形變最終導致纖維被壓潰。壓潰作用使纖維間的結合更加緊密，紙張的內部結合強度更好，紙張的物理強度性能得到提高。壓榨導致纖維的變形分為兩種，一種是纖維的柔順性引起的彎曲形變，另一種則是由于壓潰作用而發生的剪切形變，通常剪切形變貢獻著纖維的大部分變形［20］。Li等人［5］利用 CLSM獲得纖維的橫截面圖，研究分析了不同紙漿纖維的壓潰能力 (見圖6)。由圖6可以看出，薄壁的云杉BKP漿纖維很容易發生完全的壓潰;即使經過濕壓，厚壁的樺木BCTMP漿纖維也有部分的壓潰。另外，相比于化學機械漿，化學漿有更大的壓潰系數。

2.4 紙張結構

紙張是一種多相、非均質、非均勻分布且具有三維結構的網狀物材料。在紙張Z向上，纖維、涂層、填料與孔隙的結構和形態不同，這種差異會直接影響到紙張的最終性質，如內結合強度、光學性能以及油墨吸收性能等。纖維在紙張的縱向 (MD)、橫向(CD)以及厚度方向 (ZD)上存在著排列不均勻性，從而使紙張的物理性能呈三維異向性。紙張的三維多孔結構直接決定了紙張的緊度和光學性能，通過相對結合面積 (RBA)間接決定了紙張的機械性能和尺寸穩定性。紙張的內部孔隙影響紙張的緊度、物理性能以及白度等;紙張的表面孔隙影響紙張的平滑度、涂布情況以及印刷性能等。

利用SEM觀察紙張橫截面的技術已經相當成熟，但是該技術需要對紙張進行包埋切片處理，步驟繁瑣;利用CLSM的“光學切片”技術，不需對紙張進行切片處理，制樣簡單，且不損傷樣品。Somwang等人［21］利用CLSM觀察細小纖維在紙張結構中的分布，如圖7所示。結果表明，細小纖維不僅覆蓋在長級分纖維表面，還填充在長級分纖維結合的區域，可以進一步提高紙張的結合強度。借助CLSM，Moss等人［22］也發現通過添加細小纖維可以提高長級分纖維手抄片的緊度和抗張強度。ZHANG等人［23］利用CLSM觀察到紙張表面涂布殼聚糖對蜂蠟滲透有明顯的阻礙效果，如圖8所示。Ozaki等人［24］借助于CLSM研究了涂布對印刷性能的影響以及油墨在紙張中的分布和滲透情況。

圖7 紙張結構的XY截面圖和在點線處的XZ截面圖

圖8 紙張橫截面的CLSM圖［23］

圖6 不同纖維橫截面的CLSM圖

3 結語

基于激光共聚焦技術和圖像分析技術，采用共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM)可以獲得樣品的“光學切片”且不損傷樣品，還可以直接給出樣品的三維圖像，具有很高的橫向 (XY向)分辨率和信噪比。借助于CLSM，可以更直觀地檢測纖維細胞壁的厚度和橫截面的面積，分析纖維表面木素的含量和分布，研究纖維的柔韌性能和壓潰性能，觀察紙張的表面和內部結構，探究涂料和油墨在紙張表面的分布和滲透情況。從長遠來看，優于傳統光學顯微鏡的CLSM在纖維形態和紙張結構的研究中將會有更廣泛的應用。

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